Effects of egg enrichment with glucocorticoid hormone, antagonist and receptor messenger in the modulation of gene expression in zebrafish (Danio rerio) embryos with transgenerational follow up till adulthood

Questo studio è rilevante dal momento che recenti ricerche si sono concentrate sul ruolo svolto dai glucocorticoidi di origine materna e dai messaggeri codificanti per il loro recettore nella programmazione genetica dello sviluppo embrionale, con particolare attenzione alle fasi di vita successive. Tale ricerca è stata effettuata seguendo un articolato disegno sperimentale supportato dall’utilizzo di molteplici tecniche biomolecolari, quali, ad esempio, il microarray e la real time PCR sia relativa che assoluta. E’stato dimostrato che l’arricchimento delle uova di zebrafish appena fecondate con cortisolo, mediante immersione per 2 ore in una soluzione 13:M dello steroide, provoca una significativa up-regolazione di 100 geni a 5 ore dopo la fecondazione (hpf), quando nell’embrione è presente solo il cortisolo di origine materna. Nessun gene è risultato invece down-regolato allo stesso stadio di sviluppo. A 12 hpf, 143 geni sono risultati up-regolati e 6 down-regolati, con solo 30 geni in comune con l’esperimento delle 5 hpf: questo indica che probabilmente nelle fasi precoci di sviluppo embrionale avvengono dei cambiamenti sostanziali nella risposta al cortisolo materno. A 24 hpf la risposta al cortisolo interessa centinaia di geni. Successivamente ho analizzato mediante real time PCR relativa sette geni bersaglio dei glucocorticoidi durante lo sviluppo, osservando una significativa diminuzione dell’espressione dalle 10 alle 24 hpf dei geni vasp e plp1a, con ef1α come “gene housekeeping”. Inoltre ho dimostrato che quattro geni, precedentemente risultati up-regolati a 5 hpf (mat1a, notch2, parn e stmn2a), non risultano più sovraespressi a 20 hpf. Successivamente ho esteso l’analisi anche ai cambiamenti indotti dal cortisolo sull’espressione dei geni target igf-2a e casp8. In particolare ho potuto dimostrare che l’espressione di igf-2a aumenta significativamente in seguito alla microiniezione delle uova con il messaggero codificante per il recettore dei glucocorticoidi di zebrafish (z-gr mRNA), e più ancora se alla microiniezione viene abbinato il trattamento con cortisolo. Questo è stato dimostrato a 5 hpf e, in misura minore, anche a 10 hpf. Questo dato è interessante dal momento che igf-2a viene considerato il principale fattore di crescita durante l’embriogenesi. Un aumento di espressione è stato ottenuto anche per il gene casp8 con entrambi i trattamenti a 5 hpf, mentre a 10 hpf c’è una diminuzione di espressione non significativa. Mediante real time PCR assoluta ho confermato l’aumento di trascrizione del gene casp8 a 5 hpf successivamente alla microiniezione con z-gr mRNA, indipendentemente dall’aggiunta di cortisolo; una diminuzione di espressione è stata invece ottenuta sia con l’utilizzo dell’antagonista dei glucocorticoidi RU486, sia dopo silenziamento del recettore tramite microiniezione con morfolino. Sorprendentemente, a 10 hpf, le modulazioni che erano risultate precedentemente negative hanno avuto un’inversione di tendenza. La complessità dell’azione dei glucocorticoidi sull’espressione genica durante lo sviluppo embrionale è stata messa in evidenza anche dall’esperimento di real time PCR assoluta per il gene mcm6, i cui trascritti sono risultati notevolmente aumentati sia dopo trattamento con cortisolo che con RU486, quando questi reagenti sono stati utilizzati da soli; una diminuzione dei trascritti è stata invece osservata per entrambi i reagenti, sia a 5 hpf che a 10 hpf, quando sono stati impiegati contemporaneamente alla microiniezione con z-gr mRNA. Ho poi esaminato in dettaglio gli effetti di tutti i trattamenti descritti precedentemente sulla sopravvivenza delle larve dopo la schiusa (3 giorni pf) ed ho condotto uno studio sull’influenza dell’arricchimento con cortisolo sulla crescita dello zebrafish, effettuando misurazioni ad intervalli di tempo definiti, fino ai 180 giorni pf. L’analisi è stata fatta comparando una linea in cui il trattamento con cortisolo è stato ripetuto per quattro generazioni successive (F1- F4) con un’altra utilizzata come controllo non trattato. Poichè entrambe le linee erano omozigoti per differenti pattern di colorazione si è potuto anche allevarle assieme, eliminando ogni possibile influenza ambientale. Lo scopo dell’esperimento era determinare se l’esposizione dell’embrione al cortisolo, a stadi di sviluppo precoci, esercitasse un’influenza permanente sulla crescita ed inoltre spiegare il pattern transgenerazionale di tale modulazione epigenetica. Attraverso analisi statistica ho dimostrato che c’è una maggiore crescita nei trattati con cortisolo delle generazioni F1 e F2 dai 120 ai 180 giorni pf in termini di lunghezza e peso corporeo. Nelle generazioni F3 e F4 scompaiono le differenze di lunghezza rispetto ai controlli, mentre il peso corporeo risulta addirittura diminuito. Questi risultati sembrano suggerire che l’effetto iniziale del trattamento viene compensato, e non intensificato, nel corso delle generazioni, come se avvenisse una sorta di adattamento.