Plant growth promotion and biocontrol traits of Vitis vinifera "Glera" bacterial endophytes in the sustainable management of viticulture

Questa tesi presenta e discute i risultati ottenuti durante i tre anni del corso in Evoluzione, Ecologia e Conservazione della scuola di dottorato in Bioscienze presso l’Università degli studi di Padova. Il progetto di dottorato si è focalizzato sulle interazioni piante-microrganismi, in particolare tra Vitis vinifera cultivar Glera e batteri endofiti, precedentemente isolati dalla stessa specie vegetale. Il progetto mira a studiare i possibili effetti benefici che alcuni batteri endofiti, appartenenti ai generi Pantoea e Bacillus, possono conferire alle barbatelle di Glera in termini di promozione della crescita, riduzione di stress ambientali e protezione contro i patogeni. Il progetto ha come scopo la riduzione dell’utilizzo di sostanze inquinanti, come fertilizzanti chimici e pesticidi, in agricoltura e di promuovere una gestione più sostenibile della viticoltura. Innanzitutto sono stati selezionati due ceppi, Pantoea agglomerans (GL83) e Bacillus licheniformis (GL174), sulla base delle loro attività di promozione della crescita precedentemente definite; quindi entrambi sono stati trasformati con il gene che codifica la proteina fluorescente GFP e utilizzati per inoculare, in vitro, talee apicali di Glera per confermare la loro natura endofitica. Sfruttando tecniche di microscopia confocale a fluorescenza e un metodo di coltivazione diretta in piastra, è stato possibile dimostrare la capacità di tali ceppi di colonizzare i tessuti interni del fusto dopo 20 e 30 giorni dall'inoculo. L'analisi è stata poi estesa a 45, 52 e 60 giorni dall’inoculo, durante i quali le talee di vite sono state trasferite in mezzo idroponico non sterile. Entrambi i ceppi sono stati visualizzati all'interno del sistema vascolare del fusto e nei tessuti interni della radice fino a 60 giorni dall’inoculo. Il passo successivo ha previsto la messa a punto di esperimenti in campo utilizzando quattro ceppi endofiti (GL83, GL174, GL189, GL452 e il consorzio di questi quattro) i quali sono stati inoculati in due diversi momenti nella linea di produzione delle barbatelle. Nel primo test i batteri sono stati somministrati a portainnesti (Kober 5BB) e gemme di Glera durante la fase di idratazione, mentre nel secondo dopo che le barbatelle avevano sviluppato le radici. Sono stati quindi valutati sia parametri di crescita sia parametri fisiologici campionando le barbatelle in diversi stadi del loro sviluppo. I ceppi più promettenti sono stati GL83 e GL174 specialmente quando somministrati a portainnesti e gemme durante la fase di idratazione. Le piante inoculate presentavano parametri fisiologici più elevati rispetto a quelli di piante di controllo, nonché un aumento della massa radicale e della parte aerea. E’ stato anche condotto un esperimento mirato a simulare la fertilizzazione in vigneto; questo ha previsto l’utilizzo di piante di vite di 1 anno, le quali sono state irrigate una volta alla settimana per sette settimane consecutive con GL83 e GL174. I risultati emersi confermano che questi due ceppi sono due ottimi candidati per un futuro utilizzo in vigneto come bio-fertilizzanti. Inoltre, GL83 è stato in grado di alleviare gli effetti del deficit idrico in barbatelle di Glera. Infatti, le piante inoculate soggette a stress idrico presentavano parametri morfologici e fisiologici più elevati rispetto a quelli delle relative piante di controllo. Un altro tema trattato durante questo lavoro di dottorato è stato il ruolo delle tre famiglie di lipopeptidi prodotti dal genere Bacillus (surfactine, fengicine e iturine) nell’indurre risposte di difesa nelle piante. I lipopeptidi sono molecole anfipatiche prodotte come metaboliti secondari da alcuni generi batterici come Bacillus e Pseudomonas; la loro struttura li rende composti biologicamente attivi contro microrganismi potenzialmente patogeni quali batteri, funghi e micoplasmi. E’ stato inoltre riportato che queste sostanze sono in grado di scatenare risposte di difesa nelle piante, ma i meccanismi che sottendono all’attivazione di tali risposte e il percorso specifico che seguono, sono tuttora poco noti. Tramite l’utilizzo di un sistema modello semplificato come le colture cellulari in sospensione di Arabidopsis thaliana, È stato possibile studiare sia la fase di percezione dei lipopeptidi sia eventi a valle come l’espressione di alcuni geni marker di difesa. Prima di tutto è stata valutata la possibile citotossicità di questi composti utilizzando l’Evans blue test; sono state somministrate tutte le tre famiglie di lipopeptidi in commercio del genere Bacillus in tre differenti concentrazioni e in alcun caso È stata riscontrata citotossicità . Utilizzando poi una linea cellulare transgenica di Arabidopsis esprimente stabilmente la foto-proteina luminescente Ca2+-sensibile equorina nel citosol è stato possibile studiare l’eventuale coinvolgimento dello ione Ca2+ come trasduttore del segnale dopo la somministrazione di lipopeptidi. Solo la concentrazione più elevata di surfactine (50 µg/ml) ha indotto un transiente citosolico di Ca2+, suggerendo il coinvolgimento di questo ione nella percezione delle stesse. Successivamente, per studiare i possibili effetti a lungo termine delle surfactine nell’indurre le risposte di difesa della pianta sono state effettuate delle analisi di espressione genica tramite PCR semi-quantitativa dopo 2 e 6 ore dal trattamento delle colture cellulari con surfactine 50 µg/ml. I geni studiati sono stati LOX1, PR1, PAL1, NPR1 e MAPK3 considerati geni marker per risposte di difesa sistemiche indotte o acquisite, ISR e SAR. I risultati ottenuti dimostrano un’attivazione delle risposte di difesa della pianta; in particolare LOX1 e PAL1 sono risultati essere 3 volte più espressi nei campioni trattati rispetto al controllo, mentre NPR1 è risultato essere 2 volte più espresso dopo 2 ore dalla somministrazione del trattamento. Invece PR1 e MAPK3 sono risultati invariati nel livello di espressione tra cellule trattate e di controllo. L’up-regolazione di geni come LOX1 e NPR1 suggerisce l’attivazione della via dipendente dall’acido jasmonico la quale conferisce alla pianta uno stato di allerta (priming) contro successivi attacchi da patogeno. PAL1 invece è uno dei geni up-regolati in seguito all’attivazione della SAR. E’ comunque risaputo che ISR e SAR possono agire in modo sinergico aumentando le difese indotte della pianta. Analisi attraverso UPLC-MS condotte nel Lab. del Dott. Marc Ongena presso Gembloux Agro-Bio Tech (University of Liège, Gembloux, Belgio) hanno rivelato la capacità di altri ceppi endofiti di Glera del genere Bacillus di produrre lipopeptidi ciclici, surfactine e fengicine. Una sostanza in particolare, chiamata pumilacidina, è stata semi-purificata e testata in vitro tramite test di antagonismo contro alcuni batteri patogeni per le piante. I risultati hanno mostrato che questa sostanza ha una capacità anti microbica piuttosto marcata. Questo risultato preliminare deve essere confermato da ulteriori studi condotti con funghi patogeni come B. cinerea, ma è un punto di partenza importante per lo sviluppo di nuove pratiche sostenibili per il bio-controllo. In conclusione, GL83 e GL174, tra i ceppi di endofiti di vite coltivabili, si sono dimostrati essere piuttosto promettenti come bio-fertilizzanti, in quanto capaci di migliorare sia la crescita che lo stato di salute della vite. In particolare, GL83 è stato capace di promuovere la crescita e di conferire maggiore tolleranza in situazioni di deficit idrico, mentre GL174 sembra avere un’azione protettiva nei confronti di alcuni patogeni della vite. La possibilità di sfruttare gli endofiti per supportare la pianta in situazioni di stress biotici ed abiotici, in grado di interferire sulla morfologia e la fisiologia della pianta stessa e su risposte di difese sistemiche contro i patogeni, apre nuovi scenari nella gestione sostenibile della viticoltura che faccia meno uso di input chimici. I risultati di questo lavoro confermano quelli ottenuti negli ultimi anni, in cui le proprietà degli endofiti sono state studiate in una singola specie vegetale o in gruppi di genotipi strettamente correlati. Inoltre, spesso gli studi vengono condotti con specie microbiche relativamente facili da coltivare, tralasciando che il bioma della pianta È caratterizzato da ampie e complesse interazioni. Il fenotipo vegetale infatti non è determinato unicamente dalla risposta della pianta all’ambiente, ma è anche orchestrato dalla risposta dell’intero microbiota all’ambiente e dalle complesse interazioni tra gli individui e la comunità microbica della rizosfera. Le prospettive future, basate allo stesso tempo su approcci classici e tecnologie all’avanguardia (NGS), e applicate in differenti condizioni colturali, permetteranno di valutare e caratterizzare in termini genetici e metabolici gli effetti delle interazioni tra pianta ospite ed endofiti. Questo apporterà nuovi spunti e conoscenze sia dal punto di vista ecologico che evoluzionistico in merito alle interazioni pianta-microbioma-ambiente.