Synthesis and Evaluation of new prodrug systems of the natural polyphenol Curcumin

La tesi descrive la sintesi e la caratterizzazione di nuovi prodrugs carbamoilici della Curcumina ((1E,6E)-1,7-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-1,6-heptadiene-3,5-dione), un importante polifenolo naturale cui vengono accreditate molteplici proprietà benefiche ed un ampio spettro d’azione. L’utilizzo in campo farmaceutico del composto naturale tal quale è però limitato dalla sua bassa biodisponibilità dovuta a scarsa solubilità nei liquidi fisiologici ed a un rapido metabolismo epatico. Difatti, dopo somministrazione orale di Curcumina, solo tracce del composto naturale vengono ritrovate in circolo. L’approccio prodrug, rappresenta quindi un’utile opzione per aggirare questi problemi. Questo approccio è basato sulla modificazione del composto naturale mediante protezione bioreversibile e coniugazione a specifici sostituenti (promoieties) per ottenere le proprietà chimico-fisiche desiderate (solubilità, stabilità ecc). Sulla base di risultati ottenuti precedentemente con altri fenoli naturali, ho scelto ed utilizzato il legame carbamoilico per coniugare la Curcumina a due diversi tipi di promoieties, amino acidi naturali e polimeri sintetici poliossazolinici. Nello specifico, tre amminoacidi, leucina, isoleucina e valina, sono stati selezionati come promoieties più promettenti da coniugare alla Curcumina. Gli amminoacidi sono stati scelti per la loro affinità verso specifici trasportatori presenti a livello intestinale. Questo, dovrebbe favorire l’assorbimento intestinale della Curcumina a seguito della somministrazione orale dei prodrugs. Poiché la Curcumina possiede due gruppi idrossilici, ho scelto di funzionalizzarne rispettivamente uno ed entrambi mediante coniugazione con gli amminoacidi. Sono stati sintetizzati così sei prodrugs della Curcumina classificabili in mono- e di-sostituiti. Successivamente è stata testata la stabilità della Curcumina e dei prodrugs in soluzione acquosa a diversi valori di pH (1 e 6.8) al fine di mimare le condizioni di stomaco e intestino. Sono state effettuate analisi UPLC-UV, HPLC-MS, spettroscopia UV-Vis, e 1H-NMR. Nel condurre questi esperimenti, ho incontrato però numerosi problemi dovuti in particolar modo alla bassa solubilità dei composti in acqua ed alla loro tendenza a precipitare. I prodrugs hanno mostrato una maggiore stabilità in soluzioni acide, confermando le aspettative relative ai carbammati N-mono-sostituiti, la cui reattività è nota. In soluzioni a pH 6.8 (pH intestinale) sono invece state osservate alcune tracce di degradazione. L’idrolisi dei derivati è stata studiata anche tramite spettroscopia 1H-NMR usando soluzioni di D2O/DMSO-d6 a diverse percentuali di D2O. Nessuna traccia di degradazione dei prodrugs è stata osservata in queste condizioni. Gli esperimenti preliminari di farmacocinetica che sono stati condotti su topi modello, hanno inoltre provato che il derivato carbamoilico di-sostituito della Leucina è in grado di aumentare la biodisponibilità della Curcumina dopo somministrazione orale. Infine, ho verificato l’affinità della Curcumina e dei prodrugs nei confronti delle proteine plasmatiche. In particolare, ho effettuato saggi fluorimetrici di binding utilizzando l’albumina umana (HSA), importante per le sue capacità di complessamento e distribuzione di sostanze farmaceutiche nel sangue. Tutti i sei nuovi prodrugs hanno mostrato un’affinità elevata per l’albumina, superiore a quella della Curcumina stessa, ad eccezione del derivato mono-sostituito della leucina. Dall’insieme dei risultati ottenuti dallo studio dei prodrugs descritti in questa tesi è emersa la loro buona distribuzione nel circolo sanguigno e un’alta stabilità nei confronti degli enzimi epatici, evidente soprattutto per i composti mono-sostituiti, incoraggiandone così un potenziale utilizzo in campo terapeutico. L’ultimo capitolo di questa tesi descrive la sintesi di nuovi sistemi di rilascio farmaceutico ottenuti mediante un processo di auto assemblaggio di prodrugs polimerici della Curcumina con caratteristiche anfifiliche. Anche in questo caso è stato scelto il legame carbamoilico per garantire la coniugazione tra i polimeri e la Curcumina. Tra i vari polimeri, la scelta è ricaduta sulle poli-2-metil-2-ossazoline (PMOXAs) la cui somiglianza ai poli-etilenglicoli (PEGs), molto spesso utilizzati in questo campo, sommata ad una minore risposta immunitaria e ad una maggiore idrofilia rende promettente la scelta di questi composti a ruolo di promoieties. In particolare, cinque poli-2-metil-2-ossazoline, differenti tra loro per lunghezza della catena polimerica, sono state coniugate ad un solo gruppo idrossilico della Curcumina. A causa dell’elevata idrofilicità dei polimeri e della alta idrofobicità della Curcumina, questi nuovi cinque prodrugs possono essere classificati come anfifilici. Essi hanno, infatti, mostrato la capacità di auto assemblare in strutture di tipo micellare in soluzioni acquose garantendo così un’elevata solubilità della Curcumina in condizioni simili a quelle fisiologiche. Il lavoro si è concentrato in particolare sulla studio della correlazione tra la lunghezza della catena polimerica e la capacità di auto assemblare. Per tutti i derivati è stata determinata la concentrazione micellare critica (CMC), che si aggira in un intervallo di 10-6-10-4 M. Dai risultati emersi, il coniugato Curcumina-PMOXA30, caratterizzato da una CMC intorno a 10-6 M, si è dimostrato il più incline ad auto assemblare. Al contrario, sono state identificate CMC più alte per i coniugati Curcumina-PMOXA50 e Curcumina-PMOXA100 dovute probabilmente ad un bilancio sfavorevole tra le parti idrofobiche e quelle idrofiliche che, essendo più lunghe, ostacolano il processo di micellizzazione. Dall’altra parte, il derivato Curcumina-PMOXA10 ha mostrato alta tendenza ad aggregare e precipitare a causa della corta catena polimerica che in questo caso non riesce a bilanciare l’idrofobicità della Curcumina. La stabilità e le dimensioni delle micelle in soluzione acquosa sono state stimate utilizzando il light scattering dinamico (DLS) e la microscopia a trasmissione elettronica (TEM). La lunghezza della catena polimerica e la dimensione delle particelle sono risultate essere in un rapporto di inversa proporzionalità. Infatti, i coniugati costituiti da PMOXA20 e PMOXA30 presentano un diametro intorno a 100-130 nm, mentre i coniugati con PMOXA50 e PMOXA100 mostrano diametri inferiori intorno a 50-30 nm. Inoltre, tutti i coniugati, ad eccezione di Curcumina-PMOXA10, hanno dimostrato una buona stabilità in soluzione acquosa. Successivamente, ho testato il rilascio di Curcumina da ogni tipologia di micella mediante analisi UV-Vis in soluzione di buffer salino (PBS) a pH 7.4 ed a 37°C per mimare il pH sanguigno. Il coniugato Curcumina-PMOXA30 è risultato il più promettente mostrando il migliore profilo cinetico e favorendo il rilascio di circa il 90 % della Curcumina che costituisce la micella durante le prime cinque ore. Gli altri coniugati hanno invece mostrato profili diversi rilasciando, nello stesso intervallo di tempo, percentuali di Curcumina intorno al 10-30%.