Olive ripening and oil flavour in Veneto: molecular and technological aspects

L’olio extravergine di oliva è un olio vegetale molto apprezzato utilizzato principalmente per scopi alimentari a causa del profilo aromatico piacevole e a effetti salutistici noti e dimostrati, che includono proprietà antinfiammatorie e antiossidanti e una protezione nei confronti di alcune malattie cardiovascolari. La qualità dell’olio di oliva dipende da molti fattori, e tra questi fattori ambientali (clima e suolo), genetici (cultivar), agronomici e tecnologici hanno un ruolo importante. Tra i fattori agronomici, la gestione e l’uso di frutti sani e, soprattutto, la scelta dello stadio di maturazione adatto dei frutti rappresentano le variabili che hanno un ruolo fondamentale nella determinazione della qualità globale dell’olio di oliva. Le zone adatte per la coltivazione dell’olivo sono le regioni mediterranee, che sono caratterizzate solitamente da inverni miti ed estati lunghe e secche. Nonostante queste limitazioni climatiche, olivi cresciuti in zone marginali come l’Italia settentrionale conferiscono oli extravergini con profili aromatici gradevoli e di alta qualità. Le condizioni climatiche spesso avverse in queste aree rendono però necessarie un’ottimizzazione della scelta del miglior periodo di raccolta e l’implementazione di processi tecnologici allo scopo di migliorare la qualità dell’olio. Molti approcci diversi sono stati proposti finora per la definizione di un modo semplice e affidabile per valutare il periodo di raccolta corretto e massimizzare la qualità dell’olio estratto. Più in dettaglio, i cambiamenti fisiologici e biochimici che si verificano durante la maturazione dell’oliva sono stati presi in considerazione, come ad esempio la perdita di consistenza, cambiamenti del colore superficiale delle drupe, contenuto di pigmenti o loro rapporti, contenuto in zuccheri, inolizione, diminuzione di componenti fenoliche e altri. I risultati si sono dimostrati però molto spesso discordanti, a causa della grande variabilità presente tra diverse cultivar, aree di coltivazione e aspetti tecnologici. Si rende perciò necessario uno studio di questi fattori in ogni singola area di coltivazione. In questa tesi diversi approcci sono stati adottati per la caratterizzazione di una varietà coltivata localmente in Veneto, la cultivar Grignano, da cui si estrae un olio dal profilo sensoriale unico con note di buccia di limone, e per la valutazione di fattori coinvolti nella determinazione della qualità dell’olio anche attraverso un confronto con la cultivar Frantoio, una varietà diffusa comunemente in tutta Italia. Inizialmente è stato condotto uno studio che prevedeva l’estrazione di olio in atmosfera priva di ossigeno, che può essere responsabile dell’ossidazione di componenti dell’olio ma è anche un reagente richiesto nella biosintesi di composti aromatici, per valutare l’effetto dell’estrazione in atmosfera controllata sul profilo volatile globale di oli ottenuti da olive raccolte in quattro stadi consecutivi di maturazione a cavallo dell’invaiatura. L’analisi delle componenti volatili è stata condotta mediante PTR-MS (spettrometria di massa con reazione di trasferimento di protoni), una tecnica di spettrometria che permette una valutazione del fingerprint globale dei volatili senza fasi preliminari o trattamento dei campioni. Questa valutazione “real-time” dei profili spettrali di oli extravergini da cultivar Grignano unita a analisi multivariata dei dati, mediante analisi delle componenti principali e clustering gerarchico, ha permesso di proiettare i complessi spettri ottenuti tramite l’analisi spettrometrica in una heat map. I risultati hanno dimostrato che lo stadio di maturazione ha un effetto predominante sulla definizione del profilo volatile rispetto all’estrazione in atmosfera controllata, e che il progredire della maturazione è caratterizzato dalla biosintesi di specifici gruppi di molecole volatili che sembrano quindi “espresse” in modo transiente. Inoltre, è stato osservato un effetto saturazione nel profilo volatile con il progredire della maturazione. Conseguentemente, dato che lo stadio di maturazione ha un effetto prevalente rispetto ai fattori tecnologici studiati, uno studio approfondito della fisiologia della maturazione in Veneto è stato condotto ponendo particolare attenzione a perdita di consistenza, inolizione, contenuto in clorofilla a, dati colorimetrici (calcolo di indici di colore) e dati di espressione genica. I risultati hanno dimostrato che gli eventi collegati alla maturazione sono differenti nelle cultivar Grignano e Frantoio, dato che Grignano manifesta una dinamica di maturazione più precoce e rapida, sia considerando la perdita di consistenza che l’accumulo di olio nella drupa. Questi risultati suggeriscono come monitorare la maturazione in Grignano sia più difficile, dato che i cambiamenti nei parametri di maturazione si verificano molto velocemente. Inoltre, sono state osservate differenze importanti nei parametri elencati in due stagioni successive, da cui consegue una notevole difficoltà nella comprensione del profilo globale di maturazione. Sono state condotte analisi statistiche sui campioni descritti e l’analisi delle componenti principali ha stabilito che la cultivar Frantoio mostra maggiore variabilità nei dati di inolizione, confermando che il decorso di maturazione della cultivar Grignano è in qualche modo più compatto. Tra gli indici di colore calcolati nello studio, uno, cioè CI, sembra appropriato per distinguere campioni raccolti in diversi stadi di maturazione. Successivamente, per approfondire le caratteristiche aromatiche tipiche della cultivar Grignano, è stato condotto uno studio riguardante il metabolismo terpenico in olivo, con l’isolamento e la caratterizzazione di tre enzimi responsabili della biosintesi di terpeni (terpene sintasi) per la prima volta in questa specie. A questo scopo è stata condotta una ricerca approfondita di putative terpene sintasi in un database di EST (expressed sequence tag) di olivo recentemente pubblicato. I frammenti selezionati sono stati amplificati permettendo di ottenere i geni full length, le cui sequenze sono state utilizzate per dedurre le sequenze aminoacidiche che sono state espresse in E. coli. Le proteine espresse sono state sottoposte a saggi enzimatici per determinarne l’attività e una di queste si è dimostrata una geraniolo sintasi attiva, mentre le altre due proteine non hanno dato prodotti anche se la presenza di terpene sintasi inattive non è così infrequente. Analisi qPCR hanno dimostrato come le tre terpene sintasi isolate abbiano un andamento legato alla maturazione nell’espressione genica, ed è possibile perciò un loro ruolo nella determinazione del profilo aromatico. Infine, l’utilizzo della qPCR come analisi di espressione genica nei lavori precedenti ha evidenziato come geni reference validati e adatti per studi di espressione genica in olivo non siano disponibili in letteratura. Una ricerca di geni reference candidati per questo scopo è stata quindi condotta utilizzando il database di EST citato sopra e cercando in letteratura studi riguardanti la validazione di geni reference in altre specie vegetali. Sono stati quindi identificati 13 geni candidati in Olea europaea, la cui stabilità dei trascritti è stata testata sia in drupe che in foglie di olivo. Analisi di stabilità condotte mediante gli strumenti genormPLUS e NormFinder hanno dimostrato che 12 tra questi geni sono effettivamente geni reference funzionali e utilizzabili per studi di espressione genica in olivo e che, tra questi, il numero di geni ottimale da utilizzare per una buona normalizzazione dei dati corrisponde a due. I migliori geni reference identificati in questo studio, adatti per analisi di espressione genica in frutti a diversi stadi di sviluppo, sono stati GAPDH2 e PP2A1.