In vitro and in vivo studies of bioresorbable electrospun scaffolds for vascular tissue engineering: on the effectiveness of blending poly(epsilon-caprolactone) with poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate)

La struttura di un vaso sanguigno e' relativamente semplice essendo principalmente composto da uno strato di cellule muscolari lisce (SMCs) incorporato in una matrice di collagene. Il lume interno e' rivestito da cellule endoteliali (ECs) che costituiscono l'interfaccia tra il flusso sanguigno e la parete del vaso. Lo strato esterno e' ricoperto da fibroblasti (FBs) e da tessuto connettivo (Seunarine et al., 2008). Sebbene impianti autologhi di arteria e di vena rappresentino la migliore opzione clinica per il bypass o la sostituzione di vasi sanguigni stenotici a causa di processi patologici o traumi, diversi limiti influenzano questa pratica, in particolare malattie vascolari preesistenti e la limitata lunghezza o la scarsa qualita' dei sostituti (Pektok et al., 2008; Nottelet et al., 2009). Protesi vascolari in politetrafluoroetilene espanso (ePTFE) o Dacron sono attualmente utilizzate con successo per superare i limiti sopra riportati e per il bypass di condotti vascolari di medio e grande calibro, superiore a 6 mm. L' ingegneria tissutale dei sostituti vascolari (TEVGs) e' un approccio alternativo per la costruzione di vasi di piccolo diametro (<6 mm) con la possibilita'  di controllare fenomeni di trombosi, iperplasia cellulare ed eccessiva produzione di matrice. Inoltre, in vivo devono essere assicurati il mantenimento della pervieta'  del graft e di adeguate proprieta'  meccaniche e la formazione di un endotelio funzionale (Zhang et al., 2009). Questo argomento rappresenta una questione cruciale da affrontare per superare gli inconvenienti dei sostituti di piccolo diametro e per poter usufruire di questi anche nel settore della chirurgia pediatrica. Tale approccio si basa sull' utilizzo di uno scaffold polimerico poroso a cui le cellule endoteliali (ECs) possano aderire cosi' da formare un monostrato antitrombogenico con proprieta'  vasoattive (Williamson et al., 2006). Obbiettivo finale e' la realizzazione di un costrutto trapiantabile in grado di adattarsi alle modifiche dell' ospite. Lo scaffold ideale dovrebbe essere dotato di buona biocompatibilita' e biodegradabilita' . Esso dovrebbe inoltre disporre di adeguate proprieta'  biomeccaniche e di ampia disponibilita'  di svariate dimensioni per una vasta gamma di applicazioni cliniche (Tillman et al., 2009). Con la tecnica dell' elettrospinning si ottengono supporti polimerici per sostituti vascolari con particolari caratteristiche: degradazione controllata durante il rimodellamento in vivo, riproduzione di un ambiente adatto alla crescita cellulare e in grado di mimare le proprieta'  fisiche e strutturali della matrice extracellulare (ECM) nativa (Baiguera et al., 2009). Le matrici polimeriche biodegradabili prodotte con la tecnica dell' electrospinning, sono tra i materiali piu' promettenti, grazie alla loro somiglianza alla matrice extracellulare (ECM) (He et al., 2009). Il poli(epsilon-caprolattone) (PCL) e' un poliestere alifatico, ampiamente studiato come biomateriale; i suoi vantaggi sono la facilita' di fabbricazione, la duttilita'  e l' elevata resistenza meccanica. Puo' essere prodotto come scaffold tubulare con le dimensioni richieste e con porosita'  e viscoelasticita'  ottimali (Pankajakshan et Agrawal, 2010). Tuttavia, la sua generalmente scarsa affinita' cellulare, dovuta all' idrofobicita' , la mancanza di molecole segnale e la sua lenta degradazione in vivo (Nottelet et al., 2009) sono aspetti che precludono la sua considerazione come materiale ideale per l' ingegneria tissutale (Xiang et al. 2011). Di conseguenza, la realizzazione di un blend di PCL con polimeri naturali potrebbe essere un approccio promettente nel campo dell'ingegneria tissutale vascolare (Pankajakshan et Agrawal, 2010). Inoltre miscele di polimeri sintetici e naturali hanno gia'  mostrato buona citocompatibilita'  con cellule staminali mesenchimali (Tang et Wu, 2005). Il poli (3-idrossibutirrato-co-3-idrossivalerato) (PHBV) e' un materiale naturale prodotto da numerosi batteri. La sua degradazione in vivo comporta il rilascio di idrossiacidi, meno acidi e meno infiammatori rispetto ad altri polimeri bioriassorbibili (Williams et Martin, 2002). Le sue varie proprieta'  quali l'origine biologica, la biodegradabilita' , la biocompatibilita' , la non tossicita'  (Ke et al., 2010) ne fanno un buon candidato per la realizzazione di blend con PCL. Partendo da tali presupposti, in questo progetto sono stati valutati i seguenti materiali: soft poli(epsilon-caprolattone) (PCL), di origine sintetica e gia'  approvato dalla Food and Drug Administration, hard poli(3-idrossibutirrato-co-3-idrossivalerato) (PHBV), di origine microbica, e il loro blend PCL/PHBV (50% PCL/50% PHBV). Le matrici polimeriche e gli scaffold tubulari elettrofilati sono stati progettati, prodotti e caratterizzati presso l'Universita'  di Roma "Tor Vergata", Dipartimento di Scienze e Tecnologie Chimiche, dalla Prof. Alessandra Bianco e dall'Ing. Costantino Del Gaudio. Nella prima fase del lavoro, e' stata testata la citocompatibilita'  su matrici e su scaffold ricavati da strutture tubulari di piccolo calibro (diametro interno<6mm) tramite saggi in vitro utilizzando cellule endoteliali di ratti Sprague-Dawley da due diversi distretti: microcircolo cerebrale (RCEC) ed aorta (RAEC). Sono stati effettuati saggi di adesione, di vitalita'  e di proliferazione che hanno dimostrato che le matrici a base di PCL permettono la sopravvivenza e la migliore crescita delle RCEC. Nel caso di scaffold ricavati da strutture tubulari di PCL e PCL/PHBV, le RCEC hanno ricoperto la superficie dei polimeri organizzandosi in un monostrato come nei vasi sanguigni nativi. Diversamente dalle RCEC, le RAEC sono cresciute costantemente e hanno colonizzato anche le matrici e gli scaffold ricavati da strutture tubulari di PHBV. Nella seconda fase del lavoro e' stata valutata la biocompatibilita'  delle matrici polimeriche di PCL, PHBV e PCL/PHBV mediante l' impianto in vivo nel tessuto sottocutaneo dorsale di ratti Sprague-Dawley per 7, 14 e 28 giorni. Tutti i ratti sono sopravvissuti e tutti i polimeri espiantati sono apparsi conservati nel loro aspetto e forma. La colorazione con ematossilina ed eosina ha dimostrato il completo riassorbimento della capsula fibrosa a 28 giorni, sui polimeri di PHBV e di PCL/PHBV. L' infiltrato cellulare infiammatorio e' diminuito nel tempo mentre e' aumentato il numero di cellule migranti che hanno colonizzato la zona di confine tra tessuto e matrice e in parte l' interno di quest' ultima. I risultati ottenuti in vitro ed in vivo sembrano indicare il blend PCL/PHBV come possibile materiale alternativo al PCL nel campo dell' ingegneria tissutale vascolare sia per le caratteristiche intermedie tra PCL, di origine sintetica, e PHBV, di origine naturale rispettivamente, sia per la degradazione e il rimodellamento piu' rapidi in vivo rispetto al PCL