Optimized protocols for the analysis of mithocondrial respiratory chain enzymes in cells and tissues

I mitocondri sono organelli cellulari fondamentali con diverse funzioni critiche per la vita e la morte cellulare: la produzione di energia attraverso la catena respiratoria, la regolazione dell’apoptosi, il metabolismo del calcio, e la produzione di radicali dell’ossigeno. La disfunzione mitocondriale è un meccanismo patogenetico ricorrente alla base di una serie di condizioni, fisiologiche e patologiche, tra cui le malattie mitocondriali, il diabete, il cancro, varie malattie neurodegenerative, e vari fenomeni di tossicità da farmaci oppure veleni. Pertanto, l’utilizzo di metodi affidabili per lo studio delle attività enzimatiche mitocondriali è un fattore critico per studiare il ruolo dei mitocondri in tali patologie. Tuttavia, recenti osservazioni hanno evidenziato la presenza di diversi problemi analitici significativi derivanti dai protocolli precedentemente pubblicati in letteratura, tali da compromettere in alcuni casi la consistenza dei risultati. Tali problemi riguardano sia la fase pre-analitica, ovvero la fase di preparazione del campione biologico, che la parte analitica vera e propria spettrofotometrica, impattando negativamente la precisione dei saggi, la specificità e la linearità delle cinetiche. I problemi analitici più significativi riportati riguardano in particolare i saggi per il complesso I, III, e CIV, che sono anche gli enzimi più comunemente deficitari nelle malattie mitocondriali. Per sopperire a tali lacune, abbiamo sviluppato dei protocolli analitici ottimizzati per una analisi affidabile delle attività enzimatiche della catena respiratoria (complessi I-IV, I+III, II+III) attraverso un’analisi sistematica dei singoli steps analitici e pre-analitici. Per la fase di sviluppo dei protocolli abbiamo analizzato omogenati muscolari bovini con l’impiego di uno spettrofotometro a singola lunghezza d’onda. Sia l’impiego di un’efficace protocollo di lisi del campione che la scelta specifica di ciascun reagente (buffer, substrato, adiuvanti e detergenti) in un range ristretto di concentrazioni, sono risultati fattori in grado di influenzare enormemente la sensibilità, la specificità analitica e la linearità delle cinetiche. Sulla base dei risultati ottenuti abbiamo quindi selezionato i protocolli che risultassero in profili ottimali in termini analitici, permettendo di superare gran parte dei problemi analitici riportati in particolare a livello dei complessi I, III, IV. Abbiamo quindi effettuato, per la prima volta in letteratura, una analisi delle prestazioni analitiche di questi saggi biochimici, in termini di precisione, specificità rispetto all’aggiunta degli inibitori, e linearità delle cinetiche nel tempo attraverso la creazione di un indice di linearità, e la proporzionalità delle attività enzimatiche rispetto alla concentrazione di proteine. In una seconda fase abbiamo validato l’impiego di questi protocolli per campioni muscolari umani, e successivamente anche per colture cellulari, altre specie animali e organismi (topo, lievito, C. elegans), e vari tessuti murini (fegato, cuore, cervello). Questi protocolli permettono un’ analisi affidabile delle attività enzimatiche della catena respiratoria mitocondriale con l’uso di uno spettrofotometro a singola lunghezza d’onda, e non richiedono l’impiego di mitocondri isolati da tessuti. I protocolli implementati sono adatti per la diagnosi biochimica delle malattie mitocondriali, come per ricerche focalizzate sulla funzione mitocondriale in processi fisiologici o patologici. Questo lavoro fungerà da riferimento per futuri controlli di qualità e processi di standardizzazione nell’ambito della diagnostica specializzata in malattie mitocondriali.