THE ROLE OF INTESTINAL IMMUNE SYSTEM IN HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 1â MEDIATED ENTERIC NERVOUS SYSTEM DYSFUNCTIONS

Le neuropatie intestinali sono state descritte in una varietà di disturbi gastrointestinali di natura funzionale e infiammatoria. Inoltre le alterazioni neuronali sono spesso state associate alla presenza di un infiltrato infiammatorio linfocitario, ma rimangono ancora oscuri i meccanismi alla base di questi processi. I potenziali fattori eziologici sono rappresentati da virus neurotropi, i quali sono in grado di infettare specificatamente i neuroni e causare danni alle cellule attraverso meccanismi diretti o indiretti. Tra i virus neurotropici, Herpes Simplex Virus type-1 sembra mostrare diverse caratteristiche interessanti. Anche se l’HSV-1 è più comunemente noto per infettare latentemente il ganglio trigemino del nervo cranico che innerva viso e mucosa orale, HSV-1 è stato trovato anche in gangli che innervano il tratto gastrointestinale nell'uomo probabilmente come conseguenza di particelle virali ingerite. L’attività di ricerca svolta durante il mio periodo di dottorato si basa sull’ipotesi che HSV-1 è capace di infettare il sistema nervoso enterico e innescare localmente una risposta immunitaria in grado di danneggiare i neuroni del tratto gastrointestinale. Per valutare la capacità della subfamiglia degli α-Herpesviridae (HSV-1, HSV-2, VZV) di infettare il sistema nervoso enterico (SNE) umano, abbiamo effettuato uno studio di coorte prospettico su resezioni ileocoliche chirurgiche di pazienti affetti da carcinoma del colon, morbo di Crohn, colite ulcerosa e malattia diverticolare. Un totale di 121 pazienti sono stati collezionati e mediante Real Time-PCR è stata valutata la presenza di DNA virale di HSV-1, HSV-2 e varicella-zoster (VZV), nello strato muscolare intestinale che comprende il plesso mienterico. La presenza di α-herpesvirus è stata evidenziata nel 44,5% dei campioni ileali e nel 52% dei campioni estratti da colon. La frequenza di campioni positivi al DNA virale non evidenzia alcuna correlazione significata con specifiche patologie. E’ stato però osservato che i livelli di DNA virale erano significativamente maggiori nei campioni di pazienti affetti da morbo di Crohn. Inoltre, il DNA di HSV è stato rilevato più frequentemente rispetto a VZV, 46% e 3%, rispettivamente. Al fine di simulare l'infezione da α-herpesvirinae e la conseguente diffusione nel SNE umano, il mio gruppo ha messo a punto un modello murino di infezione persistente di HSV-1 nel SNE. Utilizzando questo modello abbiamo dimostrato che l’infezione intestinale da HSV-1 provoca anomalie neuromuscolari correlate al tempo d’infezione, fornendo per per la prima volta la prova in vivo che i virus neurotropi sono capaci di raggiungere e, conseguentemente, danneggiare il SNE. In particolare, significative anomalie della motilità intestinale e danni funzionali dei nervi enterici sono stati evidenziati tra le 8 e 10 settimane dopo l’inoculo intragastrico (IG) in topi infettati con HSV-1. Il mio studio si è focalizzato sulla caratterizzazione della risposta immunitaria adattativa durante l’infezione da HSV-1 con lo scopo di chiarire un possibile coinvolgimento delle cellule immuni sulle alterazione neuronali che causano disfunzioni gastrointestinali. Abbiamo analizzato la presenza d’infiltrato linfocitario nel plesso mienterico (LMMP) di topi infettati con HSV-1 ed è stato osservato un aumento del numero di linfociti CD3+ a partire dalla sesta settimana e persistenti fino alla decima settimana dopo inoculo IG. In particolare all’ottava settimana d’infezione sono stati osservati sia CD3+CD4+IL4+ che CD3+CD8+INF-γ+ specificatamente attivati e reattivi ad HSV-1, mentre alla decima settimana dopo inoculo IG vi era una maggiore presenza di CD3+CD8+INF-γ+. Con saggi d’immunoistochimica, la localizzazione dei linfociti CD3+ è stata confermata al livello dei gangli mienterici in topi inoculati con HSV-1 dalla sesta alla decina settimana post infezione. Per verificare il coinvolgimento delle cellule T CD8+ e CD4+ nelle dismotilità indotte da HSV-1 sono stati effettuati esperimenti di deplezione tramite somministrazione di anticorpi monoclonali anti-CD4 e anti-CD8. Danni al SNE e anomalie neuromuscolari sono state osservate solo dopo l'esaurimento delle cellule T CD8+ all’ottava e decima dopo inoculo IG. Per validare ulteriormente il ruolo dei linfociti T reattivi al virus nel danno neuronale, CD3+CD4+ e CD3+CD8+ sono stati isolati dal plesso mienterico di topi infetti da 8 e 10 settimane e, dopo stimolazione in vitro con HSV-1, trapianti in topi sani. Una settimana dopo il trapianto sono stati valutati gli effetti sulla motilità intestinale nei topi trapiantati. Il trasferimento di cellule T CD8+ isolate dal plesso mienterico a 8 settimane hanno causato significative anomalie neuromuscolari (p <0.01 vs controllo) in topi controllo trapianti, solo in seguito a stimolazione in vitro con HSV-1. Invece, alterazioni della motilità sono state riscontrate in seguito al trapianto di entrambe le sottopopolazioni linfocitarie, CD4+ e CD8+ isolati dal plesso mientercio di topi infetti a 10 settimane, con o senza una precedente esposizione in vitro di antigeni virali. In conclusione, in questo studio abbiamo dimostrato che α-herpesvirinae DNA è presente in una grande percentuale di pazienti e che la presenza di HSV-1 nei gangli mienterici murini innesca una robusta risposta immunitaria specifica in grado di danneggiare il SNE. Noi ipotizziamo che una persistente infezione da HSV-1 nel SNE, in soggetti predisposti, può contribuire ad alterare l'integrità funzionale neuronale favorendo l'insorgenza di disturbi intestinali.