New tissue biomarkers of Antibody Mediated Rejection in Heart Transplantation

INTRODUZIONE Il trapianto cardiaco rappresenta ancora la più importante strategia terapeutica nei pezienti con scompenso cardiaco refrattario alla terapia medica. Nell’ultimo decennio la attenzione clinica è stata rivolta al rigetto umorale in seguito al dato che la percentuale di perdita del garft per rigetto cronico non è cambiata, nonostante la terapia immunosoppressiva controlli in modo ottimale il rigetto cellulo-mediato. Il rigetto umorale viene definito come una entità clinico-patologica caratterizzata dalla presenza di anticorpi anti HLA (complesso maggiore di istocompatibilità) circolanti che provocano danno endoteliale sull’organo trapiantato con conseguente impatto sulla mortalità. Per la prima volta in biopsie renali di pazienti con disfunzione del graft in assenza di rigetto cellulo-mediato, è stato evidenziato deposito di C4d sulla superficie endoteliale, sinonimo di attivazione del complemento , strettamente correlato con la presenza di anticorpi anti HLA circolanti nel siero. Le linee guida internazionali che definiscono i criteri patologici per la diagnostica del rigetto nel trapianto di cuore, solo nel 2004 per la prima volta definiscono il rigetto umorale come entità patologica distinta indicandone i criteri diagnostici istologici e immunopatologici maggiori, riconoscendo come grado 0 assenza di segni istologici e immunopatologici e grado 1 la presenza di segni istologici e immunopatologici di rigetto umorale. Nell’ultima decade la letteratura internazione ha rivolto la propria attenzione alla ricerca del significato prognostico del rigetto umorale in relazione al rigetto cronico e alla ricerca di nuovi biomarcatori per la diagnosi precoce del rigetto umorale. Gli obiettivi della presente tesi di dottorato possono essere riassunti in tre principali puntii: 1) studio della fisiopatologia del rigetto umorale o rigetto anticorpo mediato nel trapianto di cuore; 2) valutazione della capacità diagnostica dei criteri istopatologici definiti dalle linee guida internazioni del 2004, su biopsie endomiocardiche di monitoraggio post-trapainto; 3) definizione del significato prognostico del rigetto anticorpo mediato sia nella fase precoce che tardiva post-trapianto. MATERIALI E METODI. Dal 2005, nel nostro centro di riferimento per il trapianto cardiaco dell’Università di Padova, abbiamo studiato routinariamente il biomarcatore di attivazione del complemento (C4d) con tecnica immunoistotchimica su tessuto (biopsie endomiocardiche di monitoraggio). Abbiamo valutato 1452 biopsie endomiocardiche (BEM) da 131 pazienti (età media 48.9±18.3). Popolazione adulta. Per studiare la sopravvivenza di pazienti adulti che presentano una positività al C4d nel loro follow up, abbiamo studiato 985 BEM di 107 pazienti (79% maschi) con età al trapianto di 55 anni (mediana) range 17-73 anni. La nostra popolazione adulta è stata suddivisa il quattro gruppi sulla base del profilo del C4d nelle BEM, degli anticorpi circolanti anti HLA donatore specifici (DSA), e della disfunzione del graft (riduzione della frazione di eiezione, anomalie elettrocardiogarfiche): • C4d positivo, DSA negativi, assenza di disfunzione del garft (rigetto anticorpo-mediato asintomatico)= gruppo 1 • C4d positivo, DSA positivi, assenza di disfunzione del graft (rigetto anticorpo-mediato asintomatico)= gruppo 2 • C4d positivo, DSA positivi, presenza di segni clinici di disfunzione del graft (rigetto anticorpo-mediato sintomatico)= gruppo 3. • C4d negativo, DSA negativi, assenza di disfunzione clinica del graft (gruppo controllo )= gruppo 0. Popolazione pediatrica. Abbiamo valutato 226 biopsie provenienti da 24 pazienti trapiantati (età media 8,1±6,3 anni). Tecnica immunoistochimica è stata applicata routinariamente sia nella popolazione adulta sia nella popolazione pediatrica. La tecnica immunoistochimica è stata applicata sia retrospetticamente che prospetticamente usando anticorpo policlonale per C4d. Il grading per la valutazione della colorazione immunoistochimica è stata standardizzato in quattro gradi: grado 0= negativo; grado 1= debole intensità, focale coinvolgimento dei capillari; grado 2= moderata intensità e coinvolgimento multifocale dei capillari e grado 3= colorazione intensa e coinvolgimento diffuso dei capillari. Si considera positivo grado 2 e grado 3. E’ stata inoltre eseguita l’immunoistochimica per C3d su materiale paraffinato applicando lo stesso schema di valutazione del C4d. Valutazione dei criteri diagnostici morfologici di rigetto anticorpo mediato. Delle 1452 BEM valutate, 87 erano positive per il C4d (6% 87/1452) in 61 pazienti, 26 BEM di 13 pazienti hanno mostrato un C4d positivo in più di un biopsia. Sessantasei pazienti negativi per il C4d sono stati selezionati e confrontati secondo i seguenti criteri: diagnosi pre-trapianto, età dopo il trapianto, grading del rigetto cellulo-mediato (studio caso-controllo). Tra i 61 pazienti positivi per il C4d 9 avevano rigetto anticorpo-mediato sintomatico, In questo studio caso-controllo abbiamo studiato anche il C3d. Due Patologi hanno rivisto “blindly” tutti i criteri istologici associati al rigetto umorale: edema endoteliale, edema interstiziale, cellule mononucleari intracapillari, neutrofili intracapillari, danno miocitario, necrosi miocitaria, emorragia, microtrombi intravascolari in accordo con le linee guida internazionali “ISHLT working formulation “ del 2004. Determinazione degli anticorpi anti HLA donatore specifici. La valutazione degli anticorpi circolanti è stata eseguita su 37 casi, in virtù del fatto che il nostro studio è stata condotto anche retrospetticamente. E’ stata utilizzata la tecnica Luminex per testare la reattività degli anticorpi anti HLA tipo IgG con tecnica “bead-based screening assay” da sieri ottenuti pre-trapianto e post-trapianto, quest’ultimo in concomitanza con la positività del C4d nelle BEM. Inoltre in una sottopopolazione di pazienti con rigetto umorale sintomatico gli anticorpi circolanti sono stati quantificati misurando la media di intensità di fluorescenza (MFI). Valutazione della riserva coronarica tramite tecnica ecocardiografica non invasiva. Abbiamo selezionato 19 pazienti in cui al momento della biopsia endomiocardica di monitoraggio post-trapianto è stata eseguita ecocardiograficamente.La Riserva Coronarica valutata prima e dopo l’infusione di adenosina La riserva coronarica (CFR) è stata calcolata con rapporto tra picco di velocità diastolica (iperemia) e picco di velocità diastolica (basale). Analisi statistica. Il confronto tra i vari gruppi C4d è stato calcolato con test Fisher nei caso di variabili categoriali e con test di Kruskal-Wallis per variabili quantitative. E’ stato applicato il metodo di Kaplan-Meyer per studiare la sopravvivenza dei vari gruppi positivi per C4d. Test di regressione di Cox per stimare Hazard ratio. Sono state calcolate sensibilità e specificità dei vari parametri morfologici e riportate con intervallo di confidenza del 95%. RISULTATI. Profilo clinico-patologico della popolazione adulta. Ventidue pazienti del gruppo 1 (61% del totale dei C4d positivi) mostano un rischio di mortalità 18 volte maggiore rispetto al gruppo di controllo (95% CI 1,960 – 160,022).. I sei pazienti del gruppo 2 hanno un rischio di mortalità 61 volte maggiore rispetto al gruppo di controllo (95% CI 3.399-1110.360). Gli 8 pazienti del gruppo 3 hanno un rischio di mortalità 32 volte maggiore rispetto al gruppo di controllo con una p<0,0001. Se si considerano nella totalità i pazienti C4d positivi mostrano una riduzione statisticamente significativa della sopravvivenza rispetto al gruppo C4d negativo. Si osserva un aumento del rischio di mortalità sia nei gruppi 1 e 2 (asintomatici) che nel gruppo 3 sintomatico Profilo clinico-patologico della popolazione pediatrica. Sette pazienti (33%) mostrano una positività al C4d nelle BEM di monitoraggio. Di questi 4 presentavano anticorpi anti HLA circolanti; nessuno era positivo nel gruppo di controllo. Un paziente con positività al C4d ha presentato disfunzione del graft (14% dei C4d+) entro i 3 mesi dal trapianto. Un paziente C4d positivo è morto per scompenso cardiaco dopo circa 2 anni dalla comparsa della positività del C4d nelle BEM. Gli altri cinque pazienti con C4d + sono attualmente vivi a rispettivamente 2,3,4,14 anni di follow up. Nel gruppo C4d+ il “rejection score” per rigetto cellulare è maggiore rispetto al gruppo di controllo (2,2 vs 0,2, p<0,05). Parametri morfologici per la diagnosi di rigetto anticorpo-mediato sintomatico e asintomatico nelle biopsie endomiocardiche di monitoraggio. Degli 8 criteri morfologici valutati all’ematosillina ed eosina, solo due (edema endoteliale ed interstiziale) possono essere considerati predittivi di positività capillare al C4d. la sensibilità dell’edema endoteliale è del 78,8% e la sensibilità dell’edema interstiziale è del 77,1%. Accumulo intracapillare di cellule mononucleari hanno una sensibilità del 39,3% nel predire la positività al C4d. La curva ROC mostra come i due criteri valutati assieme e riconosciuti essere i più importanti associati al danno anticorpo-mediato non aumentano la capacità di predite la presenza di anticorpi circolanti anti HLA. Immunoistotchimica per C3d nella diagnostica del rigetto umorale. Nel gruppo degli asintomatici (52 BEM di 52 pazienti) 31 BEM sono positive anche per C3d (59,6%, 31/54). Nel gruppo dei sintomatici (9 BEM per 9 pazienti) 5 BEM erano positivi al C3d (55% 5/9). La sensibilità del C3d nel predire la presenza di anticorpi anti HLA circolanti è del 42,3% e la specificità del 56%. Combinando C4d e C3d la sensibilità e specificità nel predire la presenza di anticorpi circolanti non aumenta. Profilo anticorpale nei pazienti con rigetto anticorpo mediato sitomatico. Dei 9 pazienti sintomatici della nostra popolazione studiata, 5 sono stati seguiti in follow up sia per C4d sia per anticorpi circolanti. I risultati mostrano che la quantità di anticorpo circolante (MFI) cambia in relazione al trattamento. Inoltre alti livelli di MFI >10000 correlano strettamente con grado 3 del C4d (diffuso coinvolgimento capillare con colorazione intesa), con MFI tra 1000-9000 il C4d ha una intensità ed una distribuzione variabile.; con MFI <1000 C4d è sempre negativo. C4d e microvasculopatia. La riserva coronarica di pazienti con C4d + è ridotta rispetto al gruppo di controllo rappresentato da pazienti con C4d- (1,28±0,48 vs 3,28±1,03 rispettivamente, p=0,0297) suggerendo una relazione tra il rigetto anticorpo mediato e il danno microvascolare. Anche nei pazienti senza coronaropatia del graft i pazienti con C4d+ mostrano una riserva coronarica inferiore rispetto al gruppo di controllo (C4d-) (p=0,0502). CONCLUSIONI I nostri risultati dimostrano come il C4d sia un indicatore oltre che diagnostico anche prognostico per rigetto umorale e la sua positività è sinonimo di prognosi negativa anche in assenza di sintomi clinici . La valutazione di C4d, anticorpi circolanti e disfunzione del graft ci permette di stratificare il rischio di mortalità. I parametri morfologici da soli non sono sufficientemente sensibili e specifici per la diagnostica del rigetto umorale e dunque non sono adeguati per una valutazione di screening. Alla luce dei nostri risultati raccomandiamo il C4d come test di screening per individuare pazienti asintomatici. Lo studio degli anticorpi circolanti hanno mostrato che alti livelli di anticorpi correlano con la positività capillare del C4d . Il danno endoteliale e il deposito di complemento determinano rimodellamento vascolare che porta a lungo termine