Longins and the longin domain: pivotal elements in subcellular trafficking and neuronal differentiation

Le proteine SNARE (Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptors) sono le più studiate nell’ambito del traffico subcellulare, dato il loro ruolo nella formazione del complesso di fusione delle membrane. In questa famiglia, le VAMP lunghe o longine sono caratterizzate da un dominio N-terminale denominato longin (LD), che ha una funzione sia nella formazione del complesso SNARE, sia nella localizzazione subcellulare delle proteine; le longine trovano inoltre un modello in VAMP7, Sec22b e Ykt6. Il LD adotta una conformazione chiusa che risulta stabile, ma non è ancora chiaro il contributo che tale conformazione e ogni differente dominio proteico portano alla determinazione della localizzazione stessa di tali proteine. VAMP7 umana, codificata dal gene SYBL1 è coinvolta in molteplici pathway subcellulari, compreso il controllo della crescita dei neuriti. Lo splicing alternativo nel locus di SYBL1 produce inoltre due famiglie di isoforme che mantengono un’interessante architettura di domini. Le longine non-SNARE condividono il dominio inibitorio LD, mentre le longine non-LD lo SNARE motif. Date le evidenze preliminari che conferiscono tale funzione inibitoria al costrutto artificiale LD e invece un’attività di promozione della crescita al costrutto non-LD, sembra plausibile che le due sottofamiglie rispecchino questi ruoli contrapposti. Tuttavia, i meccanismi coinvolti nella neuritogenesi non sono ancora completamente chiariti, soprattutto per quanto concerne il contributo degli stimoli extracellulari e delle diverse proteine SNARE. Questo lavoro di tesi si è incentrato sulla caratterizzazione del LD di VAMP7 e delle isoforme di splicing di questa proteina nell’ambito del loro ruolo sia nella localizzazione subcellulare, che nel differenziamento neuronale. Analisi di espressione in diversi tessuti e linee cellulari, dati quantitativi di real time RT-PCR e analisi di microscopia confocale hanno dimostrato come le varianti di VAMP7 presentino differenti tessuto-specificità e localizzazioni subcellulari; l’isoforma VAMP7i mostra inoltre una localizzazione anche nucleare. Considerando la loro diversa combinazione di domini, queste varianti di splicing fisiologiche sono state utilizzzate come strumenti per lo studio dei determinanti di localizzazione. Per di più, frammenti ricombinanti della regione citosolica di VAMP7a hanno confermato che i songoli domini non sono in grado da soli di determinare la localizzaione della proteina e che il cambiamento conformazionale aperto/chiuso non è rilevante per la localizzazione subcellulare, in assenza della regione trasmembrana. Esperimenti di gain-of-function su cellule di neuroblastoma e neuroni primari hanno mostrato l’esistenza di una regolazione della crescita dei neuriti mediata dallo splicing alternativo di VAMP7, con la produzione di isoforme sia inibitorie (VAMP7i) che stimolatorie (VAMP7dh). Tali effetti dipendono anche dal substrato (Poli-D-Lisina o Laminina) in cui i neuroni sono cresciuti e dalla co-espressione con altre isoforme di VAMP7 o con altre SNARE (VAMP2), indicando la presenza di un meccanismo di regolazione fine da parte dello splicing alternativo di VAMP7. Ulteriori investigazioni potranno portare sia alla manipolazione della neuritogenesi per scopi di terapeutici, sia al chiarimento del ruolo che le specifiche varianti di splicing possono avere in alcune malattie neurologiche. La futura caratterizzaione del LD di VAMP7 e delle sue isoforme, ad esempio il ruolo di VAMP7i nel nucleo possono definire nuovi interattori e meccanismi molecolari, utili in alcune applicazioni biotecnologiche.