Functional consequences of Familial Hemiplegic Migraine type 1 mutations on cortical activity

L’emicrania emiplegica familiare di tipo 1 (FHM1), un raro sottotipo di emicrania con aura, è causata da mutazioni missenso nel gene che codifica per la subunità α1 dei canali del calcio (Ca2+) voltaggio dipendenti CaV2.1 (tipo P/Q). I topi omozigoti knock-in (KI) recanti la mutazione FHM1 R192Q presentano, in granuli di cervelletto e in cellule piramidali corticali, un aumento della densità di corrente Ca2+ di tipo P/Q (Tottene et al., 2009; van den Maagdenberg et al., 2004). Lo studio della trasmissione sinaptica in microcolture neuronali e in fettine acute di cervello di topi KI ha dimostrato: un aumento della forza della trasmissione sinaptica eccitatoria dovuto ad un aumento dell’influsso di Ca2+ attraverso i canali di tipo P/Q localizzati a livello presinaptico e un aumento della probabilità di rilascio di glutammato alle sinapsi corticali di cellule piramidali (PYR) dei topi mutanti. Al contrario, la trasmissione sinaptica inibitoria studiata tra interneuroni fast-spiking (FS) e cellule PYR è risultata essere inalterata nei topi KI nonostante i canali di tipo P/Q siano coinvolti nel rilascio anche a queste sinapsi inibitorie (Tottene et al., 2009). Queste evidenze suggeriscono che alterazioni episodiche del bilancio tra eccitazione ed inibizione in corteccia possano essere alla base dell’aumentata suscettibilità alla cortical spreading depression (CSD, il fenomeno che sottende l’aura emicranica). Per confermare questa ipotesi mi sono concentrato sugli effetti delle mutazioni FHM1 ad altre sinapsi corticali. La connessione sinaptica tra cellule PYR ed interneuroni positivi alla somatostatina (SOM+) corrispondenti alle cellule di Martinotti in ratto, è stata studiata in topo sfruttando la disponibilità di un ceppo transgenico (GFP-expressing interneurons, GIN) che esprimono la GFP (green fluorescent protein) in una sottopopolazione di interneuroni positivi alla somatostatina per lo più considerati cellule di Martinotti (Oliva et al., 2000; Fanselow et al., 2008). Ho eseguito esperimenti di doppio patch-clamp su fettine acute di cervello di corteccia somatosensoriale primaria per studiare la connessione eccitatoria tra cellule PYR e interneuroni SOM (da qui in poi chiamati interneuroni GIN) e la connessione inibitoria reciproca in topi GIN. Ho trovato che la connessione eccitatoria PYR-GIN presenta facilitazione a breve termine (short term facilitation) in risposta a treni di potenziali d’azione (action potentials, APs) a 25 Hz suggerendo che questi interneuroni possono essere reclutati da cellule PYR durante periodi di attività neuronale sostenuta; al contrario la sinapsi inibitoria GIN-PYR è caratterizzata da una debole depressione a breve termine (short term depression, STD) in risposta a treni di APs a 20 Hz. I canali del Ca2+ che controllano il rilascio di neurotrasmettitore ad entrambe le sinapsi eccitatorie ed inibitorie tra cellule PYR ed inteneuroni GIN non sono noti; pertanto ho utilizzato un approccio farmacologico perfondendo nella soluzione extracellulare inibitori di specifici canali del Ca2+, ω-Agatoxin IVA per inibire i canali di tipo P/Q e ω-Conotoxin GVIA per inibire i canali di tipo N, per determinare il loro coinvolgimento nel controllo del rilascio di neurotrasmettitore. Questi esperimenti hanno evidenziato che i canali di tipo P/Q con un ruolo predominante e i canali di tipo N sono coinvolti e cooperano nel rilascio di neurotrasmettitore sia alla sinapsi eccitatoria PYR-GIN che a quella inibitoria GIN-PYR. Dato il coinvolgimento dei canali di tipo P/Q sarà interessante studiare eventuali alterazioni della trasmissione sinaptica eccitatoria ed inibitoria tra cellule PYR ed inteneuroni GIN in topi KI per la mutazione R192Q incrociati con i topi GIN. Per verificare l’ipotesi generale che le mutazioni FHM1 possano portare ad uno sbilanciamento in corteccia tra inibizione ed eccitazione (a scapito di quest’ultima), ho collaborato con la Dott.ssa Alessandra Fabbro nello studio della carica sinaptica eccitatoria ed inibitoria totale che una cellula PYR dello strato 2/3 riceve durante l’attività di network in assenza di stimolazione. Abbiamo effettuato registrazioni di voltage clamp al potenziale di reversione degli input inibitori (-79 mV) e a quello degli input eccitatori (+ 10 mV) per poter isolare rispettivamente le correnti postsinaptiche eccitatorie (spontaneous excitatory postsynaptic currents, sEPSCs) e quelle inibitorie (spontaneous inhibitory postsynaptic currents, sIPSCs). Gli esperimenti di voltage clamp hanno messo in evidenza due tipi di attività. La prima è caratterizzata da correnti postsinaptiche spontanee (spontaneous postsynaptic currents, sPSCs) generate da input non correlati, eccitatori o inibitori, che arrivano in modo casuale da cellule eccitatorie PYR ed interneuroni inibitori connessi con la cellula da cui si esegue la registrazione; il secondo tipo di attività è caratterizzato da burst di PSCs di grandi ampiezze e che originano dall’attività correlata, forse attraverso meccanismi di network, di grandi popolazioni di cellule eccitatorie o inibitorie che formano sinapsi sulla cellula registrata. Il calcolo dell’integrale delle sPSCs non correlate in fette acute di corteccia somatosensoriale da topi WT e KI indicano che la carica eccitatoria delle sPESCs non correlate è aumentata nei topi KI in accordo con l’aumentato rilascio di glutammato e un aumentata trasmissione sinaptica eccitatoria alle sinapsi tra cellule PYR di topi KI (Tottene et al., 2009); al contrario la carica inibitoria mediata dalle sIPSCs non correlate risulta non essere alterata nei topi KI in accordo con l’inalterata trasmissione sinaptica inibitoria tra interneuroni FS e cellule PYR (Tottene et al., 2009). L’analisi delle aree dei grandi burst di input correlati ha evidenziato che sia la carica eccitatoria che quella inibitoria dei burst sono aumentate nei topi KI ma il rapporto tra carica eccitatoria ed inibitoria risulta essere inalterata nei topi KI. Questi risultati indicano che durante l’attività spontanea di network il bilancio tra eccitazione ed inibizione non è alterato. L’incremento della carica eccitatoria ed inibitoria nei topi KI è dovuto ad un aumento nella frequenza dei burst da cui consegue un aumento nel tempo trascorso dalla corteccia nell’attività spontanea correlata nei topi KI.