Pathogenesis-related Proteins From Helicobacter pylori: Structural and Functional Studies

Il batterio Helicobacter pylori è riconosciuto essere uno dei più diffusi patogeni umani: esso colonizza circa la metà della popolazione umana, con una elevata velocità di propagazione nei paesi in via di sviluppo. Benché molti soggetti infetti siano asintomatici, una significativa minoranza di questi (15-20%) sviluppano durante la loro vita patologie duodenali gravi, che includono ulcera gastrica e duodenale, adeno-carcinoma e linfoma dello stomaco. Fino ad oggi sono stati completamente sequenziati nove diversi ceppi di H. pylori, in quanto esso presenta una alta variabilità genetica, non solo nelle sequenze geniche, ma anche nel contenuto di geni. Molti dei geni del batterio sono annotati solo sulla base dell’omologia di sequenza e per circa il 45% di essi la funzione è incerta o addirittura ignota. La differenza più significativa tra i ceppi virulenti del batterio rispetto ai ceppi non virulenti è la presenza o assenza della cosiddetta cag-PAI (una sequenza del DNA di 40-kb definita “isola di patogenicità cag”), un inserto genico che codifica per un sistema di secrezione di tipo IV, responsabile della trasloscazione della tossina CagA nelle cellule epiteliali. Benché H. pylori in molti pazienti possa essere sradicato mediante antibiotici, l’aumento della resistenza in alcuni ceppi rappresenta un problema emergente. Nuove terapie sono richieste per combattere il batterio e l’individuazione di nuovi bersagli farmacologici può essere utile per sviluppare nuove strategie di trattamento. Recentemente, nuovi fattori importanti per la colonizzazione e per lo stabilirsi dell’infezione sono stati identificati. In questo lavoro di tesi, un gruppo di queste proteine sono state clonate, espresse in E. coli e purificate allo scopo di effettuare studi strutturali. Obiettivo della tesi era quello di determinare la struttura tridimensionale e caratterizzare la funzione di proteine importanti per la colonizzazione dello stomaco e per la patogenesi. In particolare, gli sforzi sono stati concentrati sugli enzimi coinvolti nella modifica della parete cellulare (peptidoglicano deacetilasi), nella biosintesi di LPS (ADP-L-glycero-D-manno-eptoso-6-epimerasi, rfaD), su una periplasmic-substrate binding protein di un trasportatore ABC (ceuE), su enzimi chiave nel ciclo di assimilazione dell’azoto (glutamina sintasi) e sulla disolfuro ìsomerasi (DsbG), una proteina immunogenica secreta. La strategia applicata è consistita in una analisi bioinformatica preliminare, nell’ottenimento del gene a partire da amplificazione mediante PCR, nella costruzione di un vettore per la clonazione e nell’espressione della proteina in E. coli. Dopo analisi dell’espressione e ottimizzazione delle condizioni, è stata analizzata la solubilità della proteina ricombinante. Quest’ultima è stata quindi purificata mediante diverse tecniche cromatografiche, ed eventualmente caratterizzata per gel-filtrazione analitica, spettrometria di massa, spettroscopia UV. Sono state usate tecniche per rendere i campioni di proteina più adatti per la cristallizzazione, quali DLS (dynamic light scattering) e per investigarne la struttura secondaria, quali CD (dicroismo circolare). La proteina è stata quindi concentrata prima di essere sottoposta ai test di cristallizzazione. I dati di diffrazione sono stati misurati ai sincrotroni ESRF (Grenoble, Francia). La caratterizzazione funzionale delle proteine è stata eseguita usando spettroscopia di fluorescenza, CD, ITC, UV ed ELISA. Dopo una introduzione generale sul batterio (Capitolo 1), nel capitolo 2 viene descritta la struttura tridimensionale e l’attività enzimatica di una putativa peptidoglicano deacetilasi. HP0310 (HpPdgA) da H. pylori è stato indicato come l’enzima responsabile della modifica del peptidoglicano che serve a minimizzare la risposta immunitaria da parte dell’ospite. L’enzima, che appartiene alla famiglia delle polisaccaride deacetilasi, è un omo-tetramero. Le quattro catene polipeptidiche, ciascuna avvolta in un dominio singolo caratterizzato da un TIM-barrel non canonico, sono arrangiate attorno ad un asse di rotazione quaternario. Il sito attivo, uno per monomero, contiene uno ione coordinato in modo simile ad altre deacetilasi. L’enzima non presenta però in vitro attività sui tipici substrati delle peptidoglicano deaetilasi. In netto contrasto con altre peptidoglicano deacetilasi conosciute, HpPdgA non ha un sito di legame accessibile ad una molecola ingombrante quale un polisaccaride, suggerendo che l’enzima leghi nel proprio sito attivo un substrato di piccole dimensioni. Nel capitolo 3 viene discussa in dettaglio la struttura cristallina dell’ultimo degli enzimi del ciclo della biosintesi dell’oligosaccaride (L,D-eptoso) del core di LPS. H. pylori deve molta dell’integrità della sua membrana esterna ai lipopolisaccaridi (LPS). Insieme al loro esenziale ruolo strutturale, gli LPS contribuiscono alle proprietà di aderenze del batterio, come anche alla modulazione della risposta immunitaria. L’oligosaccaride del core del batterio, uno dei tre principali domini dell’LPS, presenta una struttura peculiare nell’organizzazione della ramificazione delle unità che si ripetono. Queste mostrano ulteriore variabilità quando si confrontano ceppi diversi. In questo capitolo viene presentata la struttura cristallina della ADP-L-glicero-D-manno-eptoso-6-epimerasi (HP0859, rfaD), l’ultimo enzima del ciclo che produce L-glicero-D-manno-eptoso partendo da sedoeptuloso-7-fosfato, un composto cruciale nella sintesi dell’oligosaccaride del core. In uno studio recente è stato caratterizzato un mutante knok-out di HP0859 che mostra, in un modello di infezione in cellule AGS, una seria perdita di struttura del lipopolisaccaride e una significativa riduzione dei livelli di adesione, se paragonato ai ceppi wild-type. La struttura cristallina rivela che l’enzima è un omo-pentamero e che NAD è legato come cofattore in una cavità altamente conservata. Il sito di legame del substrato è molto simile a quello del suo ortologo in E. coli, suggerendo anche un simile meccanismo catalitico. Altri enzimi del ciclo sono discussi nei termini della loro struttura tridimensionale. Nel capitolo 4 viene descritta la struttura tridimensionale di una binding-protein al trasportatore periplasmico ABC. E’ noto dalla letteratura che il batterio può utilizzare l’eme come sola sorgente di ferro, e sono state identificate sorgenti di ferro, derivanti dall’ospite, utilizzate da H. pylori, inclusi composti provenienti da gruppi eme da tessuti danneggiati. Il trasporto di eme entro il citoplasma è effettuato da un sistema di trasporto attivo che comprende una proteina periplasmica solubile, una permease citoplasmatica e una ATPase (ABC transporter). La proteina periplasmica che lega l’eme è stata identificata e caratterizzata in vari batteri patogeni, ma fino ad ora non era ancora stata identificata una heme-binding protein in H. pylori. Hp1561 (ceuE) era annotata come una “ABC transporter periplasmic binding protein”, ma un gene omologo from H. mustalae era stato riportato essere coinvolto nel trasporto del nichel. Per chiarire le caratteristiche strutturali di questa putativa proteina di trasporto, essa è stata clonata, espressa e purificata con buona resa in E. coli, cristallizzata e la sua struttura determinata nella forma apo- and in complesso con il Ni(II). La struttura è stata risolta per mezzo di esperimenti di dispersione anomala singola (SAD) su cristalli di Se-metionina. Il modello molecolare è costituito da due domini, collegati da una lunga α-elica e presenta le caratteristiche generali di altre “heme-binding periplasmic ABC transporters” o di “B12 binding-proteins”. Il sito di legame del substrato è localizzato tra i due domini. La struttura cristallina suggerisce che il Ni(II) non è il legante naturale della proteina e che la cavità di legame assomiglia di più a quella delle heme-binding proteins. Sono stati effettuati anche studi di legame in vitro con tecniche diverse (fluorescenza e ITC), che hanno confermato che ceuE in H. pylori è una “periplasmic heme-binding protein”, responsabile per l’assunzione dell’eme. La struttura cristallina di un enzima chiave nell’unico ciclo di assimilazione dell’azoto in H. pylori è discusso nel capitolo 5. La glutamina sintetasi (GS) catalizza la sintesi di glutamina, un intermedio centrale nel metabolismo dell’azoto, da ATP, glutammato e ammoniaca, in una reazione dipendente da un catione bivalente. L’ammoniaca, che è anche una sorgente preferita di azoto per H. pylori, è disponibile in grande quantità, grazie all’attività ureasica del batterio. E’ assimilato in proteine e altri composti contenenti azoto attraverso un singolo ciclo di incorporazione dell’azoto, mediato da GS, un enzima codificato dal gene hp0512. L’assenza di un sito si regolazione allosterico (sito di adenilazione) e di altri enzimi chiave nel ciclo di assimilazione dell’azoto rende HpGS un interessante soggetto per gli studi strutturali, per chiarirne le caratteristiche strutturali e il meccanismo regolatorio. La glutamina sintetasi (HpGS) di H. pylori è stata clonata, espressa, purificata e cristallizzata e la sua struttura determinata. L’enzima è un dodecamero, i cui monomeri sono tenuti assieme soprattutto da interazioni idrofobiche e legami ad idrogeno tra i due anelli esamerici. L’elica N-terminale, chiamata “elica stringa”, è inserita in una cavità idrofobia nella subunità eclissata sull’anello esamerico opposto. In aggiunta, il canale centrale del dodecamero è formato da sei fogli L a quattro fogli beta, ciascuno costituito da un loop antiparallelo cui contribuiscono subunità in anelli opposti. La struttura di un monomero consiste di un piccolo dominio N-terminale e di un dominio C-terminale più grande. L’enzima dodecamerico contiene 12 siti attivi, ciascuno dei quali può essere descritto come un “bifunnel”, in cui ATP e glutammato legano da lati opposti. Il sito di legame dell’ATP è localizzato nella parte alta del bifunnel, alla giunzione del quale ci sono due siti per il legame di cationi bivalenti. Il sito di adenilazione che in tutti gli enzimi omologhi contiene la sequenza consenso NLYDLP è sostituita in H. pylori da NLFKLT (residui da 405 a 410). Poiché la tirosina 407 è il bersaglio conservato dell’adenilazione e H. pylori apparentemente manca di questo residuo, non c’è adenilazione nell’enzima e non si osservano modifiche strutturali significative in questo loop a confronto con altre strutture di GS. Nel capitolo 6 vengono discussi la clonazione, l’espressione e la caratterizzazione della proteina immunogenica secreta DsbG. Le proteine coinvolte nell’isomerizzazione dei ponti disolfuro sono ben note. Esse sono localizzate nelle membrane o nel periplasma e sono chiamate Dsb (Disulfide bond formation). Questi enzimi catalizzano l’introduzione di ponti disolfuro, la loro isomerizzazione o rimozione. Secernere alcune proteine è un modo attraverso il quale un batterio può interagire con l’ospite e in H. pylori questo avviene attraverso uno dei tre sistemi di secrezione di tipo IV presenti. Molte tra le proteine secrete, alcune delle quali risiedono nello spazio periplasmico, formano ponti a disolfuro dopo la traslocazione. HP0231 ha una sequenza simile a Dsbg di E. coli e contiene un motivo CXXC. Essa è stata già identificata come una proteina immunogenica riconosciuta da sieri di pazienti. La proteina ricombinante, espressa in E. coli, non lega fortemente alla resina di affinità IMAC-Ni2+, probabilmente a causa di degradazione dell’His-tag presente all’N-terminale. Per risolvere il problema della purificazione sono perciò stati adottati due approcci: è stato preparato un nuovo costrutto di HP0231 con His-tag al C-terminale, e in parallelo la proteina è stata purificata dai corpi di inclusione e poi rifoldata. La proteina è infine stata purificata ad alta omogeneità. HP0231 è stata caratterizzata usando tecniche immunologiche e blot con sieri di pazienti.