Drug metabolizing enzymes and transporters in bos taurus and cryopreserved pig hepatocytes: constitutive expression and transcriptional modulation

L’esposizione a xenobiotici può modulare la trascrizione di un ampio spettro di geni espressi in tessuti ed organi diversi tra cui fegato, rene, intestino, polmone, cervello, placenta e pancreas al fine di favorirne il metabolismo ed il processo di escrezione (Tolson e Wang, 2010). La superfamiglia genica dei fattori di trascrizione codificante per i recettori nucleari è responsabile dell’attivazione del meccanismo di detossificazione dello xenobiotico regolando, a livello trascrizionale, l’espressione degli enzimi del metabolismo di fase I e II, nonché di fase III (trasportatori di membrana; di Masi et al., 2009). Nel corso degli ultimi dieci anni, nell’uomo e nelle specie da laboratorio è stato chiarito il meccanismo di attivazione dei geni regolati dai recettori nucleari; nonostante ciò, poche informazioni sono tutt’ora disponibili per quanto riguarda le specie di interesse veterinario. Scopo di questa Tesi di Dottorato, presentata in forma di “collection papers” è stato in primis di proporre una nuova nomenclatura tramite un’accurata analisi filogenetica, per le sequenze di bovino del citocromo P450 coinvolte nel metabolismo degli xenobiotici. In seguito, sono state implementate le conoscenze riguardanti la distribuzione tissutale e la regolazione degli enzimi coinvolti nel metabolismo degli xenobiotici nel bovino e nel suino, due delle specie veterinarie da reddito più importanti. A questo proposito, è stato condotto uno studio volto a delucidare gli effetti pre-trascrizionali del fenobarbitale, nel fegato e in tessuti extra-epatici di bovino, sui principali recettori nucleari, enzimi biotrasformativi e trasportatori di membrana,. Oltre a ciò, in epatociti crioconservati di suino, sono stati valutati gli effetti a livello trascrizionale e post-traduzionale del tempo in coltura e di classiche molecole induttrici del citocromo 3A sui principali recettori nucleari ed enzimi di fase I. L’analisi filogenetica ha rivelato numerose imprecisioni nell’attuale nomenclatura utilizzata per le sequenze di citocromo P450 nel bovino. I cambiamenti proposti riprendono prevalentemente la nomenclatura in uso per la specie la cui sequenza è risultata ortologa a quella di bovino, mentre, per le sequenze alle quali non è stato possibile assegnare con certezza una relazione di ortologia, è stato creato un nuovo acronimo. La distribuzione tissutale nel bovino osservata per i fattori di trascrizione, enzimi del metabolismo e trasportatori presenta alcune caratteristiche comuni con l’uomo e specie da laboratorio. I risultati ottenuti non sarebbero pertanto indicativi di un profilo di espressione bovino-specifico di tali geni, anche non si può escludere la presenza di un meccanismo di induzione tessuto-specifico. Il fenobarbitale ha indotto a livello epatico la trascrizione dei citocromi appartenenti alle famiglie 2B, 2C e 3A nonché quella di enzimi coniugativi quali l’UDP glucuronosiltransferasi 1A1-like e la glutatione S-transferasi α 1-like. Per quanto riguarda i tessuti extra-epatici, nell’intestino è stato osservato un generale effetto inibitorio (significativo per sulfotransferasi 1A1-like). Anche nel bovino, il fegato, l’intestino e il testicolo si sono rivelati essere gli organi che esprimono geni codificanti per proteine di afflusso ed efflusso e l’espressione del trasportatore ATP-binding cassette C2 è stata significativamente aumentata a livello epatico dal fenobarbitale. Diversamente, nel rene il livello di mRNA dell’ ATP-binding cassette G2 è stato significativamente ridotto. Similmente a quanto riportato in studi effettuati in precedenza su epatociti primari di diverse specie (inclusa quella suina) preparati a fresco e crioconservati, è stata osservata una diminuzione in funzione del tempo nel contenuto di citocromo P450 (sia livello di trascritto sia di proteina), mentre per i recettori nucleari non è stata evidenziata nessuna differenza in termini di risposta. L’esposizione a molecole induttrici del citocromo 3A (soprattutto a desametasone) ha significativamente indotto l’espressione dei geni codificanti per i recettori nucleari e gli enzimi di fase I, e per quest’ultimi tale modulazione è stata confermata anche a livello post-traduzionale. Concludendo, lo studio dei profili di espressione genica si è rivelato un metodo precoce e sensibile per determinare la modulazione degli enzimi del metabolismo da parte degli xenobiotici rispetto agli studi effettuati a livello proteico e di attività catalitica. I risultati ottenuti dallo studio della distribuzione tissutale e di induzione dei recettori nucleari, enzimi deputati al metabolismo e dei trasportatori nel bovino contribuiscono ad implementare la conoscenza del metabolismo non solo nel fegato ma anche nei tessuti extra-epatici. Infine, è stato dimostrato che gli epatociti crioconservati di suino, anche se stoccati per lungo tempo, possono considerarsi uno strumento valido per lo studio dei meccanismi di regolazione di quei geni che richiedono un inalterato apparato trascrizionale.