Fungal cell wall degrading enzymes and plant inhibitors: role during plant infection and strategies to increase plant resistance

Durante il processo infettivo i patogeni producono un gran numero di enzimi degradativi della parete cellulare, tra cui endo-xilanasi e poligalatturonasi, così da superare la barriera rappresentata dalla parete cellulare della pianta ospite e ottenere sostanze nutritive. Le xilanasi idrolizzano lo xilano, un polisaccaride particolarmente abbondante nella piante monocotiledoni, e alcune sono state dimostrate essere in grado di causare necrosi e risposta ipersensibile nel tessuto ospite. Le poligalatturonasi sono secrete da microorganismi patogeni durante le prime fasi del processo infettivo e sono implicate nella degradazione della pectina. Le poligalatturonasi e le xilanasi fungine svolgono un ruolo importante durante la patogenesi, ma non si conosce in modo approfondito come contribuiscano alla virulenza del fungo patogeno Fusarium graminearum, l’agente causale della fusariosi della spiga. In questo lavoro sono stati deleti, tramite ricombinazione omologa sito-specifica, il fattore trascrizionale Xyr1 (che regola putativamente l’espressione di diversi geni codificanti per enzimi xilanolitici) e la principale poligalatturonasi del fungo, codificata dal gene pg1, producendo i mutanti singoli ∆xyr and ∆pg. I mutanti derivati dalla delezione del gene pg1 hanno mostrato una bassissima attività poligalatturonasica e una virulenza ridotta su soia ma non su frumento; il mutante ∆xyr ha presentato una drastica diminuzione dell’attività xilanasica, ma una virulenza comparabile al wild type sia su soia che su frumento. Per stabilire quindi un possibile effetto sinergico tra le attività xilanasica e poligalatturonasica di F. graminearum, è stato prodotto il doppio mutante ΔΔxyr/pg trasformando i protoplasti del mutante singolo ∆pg. I mutanti ΔΔxyr/pg hanno presentato una ridotta capacità di crescere quando sono stati allevati in coltura liquida con xilano come unica fonte di carbonio e una forte diminuzione delle attività xilanasica e poligalatturonasica rispetto al ceppo wild type. La virulenza dei mutanti ΔΔxyr/pg su soia e spighe di frumento è rimasta notevolmente ridotta rispetto a quella dei mutanti singoli. L’effetto sinergico delle attività xilanasica e poligalatturonasica è stato quindi confermato incubando le pareti cellulari di frumento in presenza di PG1 e di due tra le più espresse xilanasi di F. graminearum purificate. Siccome precedentemente è stato dimostrato che la xilanasi FGSG_03624 di F. graminearum causa risposta ipersensibile in frumento, è stata indagata l’abilità di questa xilanasi nell’indurre risposte di difesa in Arabidopsis. Trattamenti esogeni con questa proteina hanno indotto l’espressione del gene di difesa PDF1.2 e hanno mostrato una riduzione dei sintomi causati dal batterio Pseudomonas syringae pv. maculicola ma nessun effetto contro il fungo Botrytis cinerea. La proteina è stata quindi transientemente espressa in foglie di tabacco e costitutivamente espressa in Arabidopsis dopo una mutagenesi nel sito catalitico che ha abolito l’attività xilanasica. Quando infettate con B. cinerea, le foglie di tabacco e di Arabidopsis hanno mostrato uguale suscettibilità rispetto alle rispettive foglie di controllo. Contrariamente a quanto osservato con i trattamenti esogeni, le piante transgeniche di Arabidopsis non erano più resistenti all’infezione di P. syringae. Tra i meccanismi di difesa sviluppati per contenere l’ infezione di patogeni, le piante possiedono specifici inibitori, solitamente presenti nella parete cellulare, capaci di ridurre o bloccare completamente l’attività degli enzimi degradativi secreti dei funghi patogeni. In Triticum aestivum è stata identificata una famiglia di inibitori xilanasici (TAXI) capace di inibire la xilanasi Xyn11A di B. cinerea, un fattore di virulenza del fungo. Geni codificanti TAXI sono stati espressi in tabacco e Arabidopsis e le piante trasformate sono state infettate con B. cinerea. Mentre l’espressione transiente di TAXI nelle foglie di tabacco ha determinato una maggiore resistenza contro il fungo, l’espressione costitutiva in Arabidopsis non ha prodotto nessun effetto positivo.