Mechanisms of induction and propagation of cortical spreading depression in mouse brain slices

L’emicrania è un disturbo neurologico comune ed altamente invalidante che colpisce più del 10% della popolazione in generale; nel 30% dei pazienti affetti da emicrania, la fase del dolore è preceduta da sintomi neurologici transienti definiti nel complesso “aura emicranica”. L’emicrania emiplegica familiare di tipo 1 (FHM1) è una forma autosomica dominante di emicrania con aura rara ma molto grave; l’FHM1 è considerata un buon modello per lo studio dell’emicrania: gli attacchi tipici di FHM1, infatti, ricapitolano molto quelli della normale emicrania con aura, tuttavia durante l’aura si presentano sintomi come debolezza motoria o paralisi, spesso ma non sempre unilaterale. L’FHM1 è dovuta a mutazioni nel gene CACNA1A che codifica la subunità α1 formante il poro dei canali Ca2+ neuronali voltaggio dipendenti CaV2.1, chiamati anche canali per il calcio di tipo P/Q. Le mutazioni FHM1 producono un guadagno di funzione dei canali ricombinanti umani CaV2.1; tale guadagno di funzione è principalmente dovuto allo spostamento della curva di attivazione del canale verso valori di potenziale più negativi e all’aumento della probabilità di apertura e dell’influsso di Ca2+ a livello di singolo canale in un ampio intervallo di potenziali vicini alla soglia di attivazione del canale (Hans et al., 1999; Tottene et al., 2002, 2005). Studi in vivo (van den Maagdenberg et al., 2004) ed in vitro (Tottene et al., 2009) hanno dimostrato come topi knock-in (KI) per la mutazione umana FHM1 R192Q presentino una facilitazione nell’induzione sperimentale della cortical spreading depression, il fenomeno neurologico alla base dell’aura emicranica e possibile evento innescante il tipico mal di testa caratterizzante l’emicrania. Dal punto di vista elettrico la CSD è un’onda di forte depolarizzazione neuronale e gliale, che si propaga lentamente attraverso la corteccia cerebrale ed è seguita da una lunga fase di soppressione neurale. Recentemente Tottene e colleghi (2009) hanno dimostrato un aumento nella trasmissione sinaptica eccitatatoria corticale dei topi FHM1 R192Q; tale aumento è dovuto all’aumentato influsso di Ca2+ evocato da potenziali d’azione attraverso i canali CaV2.1 ed al conseguente aumento nella probabilità di rilascio del neurotrasmettitore glutammato alle sinapsi piramidali di questi topi. Attraverso l’impiego di un modello in vitro, Tottene e colleghi hanno, inoltre, dimostrato il rapporto di causalità tra l’aumentato rilascio di glutammato dai neuroni piramidali e la facilitazione nell’induzione della CSD tramite brevi applicazioni pressorie di KCl a concentrazioni elevate in fettine di cervello da questi topi. Tali evidenze supportano l’ipotesi di un ruolo chiave dei canali CaV2.1 nei meccanismi di induzione e propagazione della CSD. La prima parte del mio progetto di dottorato ha avuto come scopo fondamentale l’approfondimento delle conoscenze riguardo i meccanismi che sottendono induzione e la propagazione della CSD; in particolare il mio interesse si è principalmente soffermato sul ruolo dei canali del calcio voltaggio-dipendenti e dei recettori NMDA. I risultati ottenuti sono stati pubblicati (Tottene et al., 2001, pdf allegato nel capitolo 3). Per conseguire gli scopi prefissi abbiamo impiegato il modello in vitro già in precedenza adottato da Tottene e colleghi (2009) ed abbiamo misurato la soglia di induzione della CSD e la velocità di propagazione della stessa in fettine corticali di topo wild-type (WT) prima e dopo l’applicazione di vari inibitori selettivi dei canali d’interesse. La durata del primo impulso in grado di indurre una CSD veniva considerata la soglia di induzione della stessa, mentre la velocità di propagazione della CSD coincideva con la velocità di propagazione dei cambiamenti nel segnale ottico intrinseco (IOS) associati ad essa. Il ruolo dei recettori NMDA è stato indagato mediante l’impiego di un inibitore selettivo in concentrazione saturante: D-AP5, 50 µM. In presenza di D-AP5 stimoli fino a 30 volte la soglia controllo non erano in grado di indurre una CSD. Abbiamo inoltre indagato il ruolo dei canali per il Ca2+ voltaggio-dipendenti di tipo P/Q, N, R ed L, usando i rispettivi inibitori specifici: ω-agatossina IVA (300 nM), ω-conotossina GVIA (1 μM), SNX-482 (250 nM) e nimodipina (50 μM). Similmente a quanto osservato in presenza di D-AP5, in presenza di ω-AgaIVA, stimoli fino a 30 volte la soglia controllo non erano in grado di indurre una CSD. Diversamente, l’applicazione di ω-CgTxGVIA o di SNX-482 provocava un lieve innalzamento della soglia (di circa il 10%) e una leggera diminuzione della velocità (di circa il 15%), suggerendo un ruolo modulatore dei canali per il calcio voltaggio-dipendenti di tipo N ed R nell’induzione e nella propagazione della CSD. Al contrario l’applicazione di nimodipina non aveva alcun effetto sulla soglia o sulla velocità della CSD. La dimostrazione che D-AP5 e ω-AgaIVA sono in grado di inibire totalmente l'induzione e la propagazione della CSD, mentre CgTxGVIA, SNX-482 e nimodipina presentano solo un lieve effetto, o nessun effetto, sono consistenti con ed avvalorano un modello di induzione e propagazione della CSD nel quale l’attivazione dei canali CaV2.1 presinaptici (e forse anche di quelli postsinaptici) e dei recettori NMDA ha un ruolo essenziale (Tottene et al., 2011). Il ruolo dei recettori NMDA è stato ulteriormente indagato, sfruttando i topi KI FKM1 R192Q, che presentano un incrementato rilascio di glutammato da parte dei neuroni piramidali. Contrariamente a quanto riscontrato nei WT, in questi topi l’applicazione di D-PA5 non era in grado di bloccare l’induzione della CSD, ma aumentava invece significativamente la soglia (90 ± 9%) e diminuiva significativamente la velocità (47 ± 1%) rispetto al controllo. Il diverso effetto del D-AP5 riscontrato nei topi WT ed in quelli KI potrebbe suggerire che altri elementi (oltre ai recettori NMDA) potrebbero essere coinvolti nell’induzione e nella propagazione della CSD. Registrazioni in current-clamp in prossimità del sito di eiezione del KCl, alle distanze fisse di 100 e 200 µm, hanno permesso di osservare e distinguere diverse fasi nei cambiamenti di voltaggio indotti dall’applicazione di stimoli di KCl sottosoglia e a soglia; è stato infatti possibile osservare la presenza di tre diversi picchi. Mentre i primi due picchi erano condivisi dalle depolarizzazioni sottosoglia e dalla CSD, la comparsa del terzo picco era specificamente legata all’induzione della CSD. La tecnica del patch-clamp ha permesso di descrivere nel dettaglio le diverse fasi di depolarizzazione, mostrando tuttavia l’ovvia restrizione di limitare l’osservazione ad una sola cellula per volta. Il Ca2+ imaging di fettine caricate con l’indicatore Ca2+ sensibile OGB1-AM ha invece permesso di monitorare allo stesso tempo diversi neuroni a diverse distanze dalla pipetta iniettante KCl dopo lo stesso stimolo. L’esecuzione simultanea di patch clamp e Ca2+ imaging nella stessa fettina ha dimostrato una generale correlazione tra le diverse fasi dei cambiamento di voltaggio registrate in current-clamp ed i picchi nelle tracce di fluorescenza. I possibili significati fisiologici e gli eventuali ruoli nell’induzione e nella propagazione della CSD di queste diverse fasi non sono ancora chiari e sono al momento attuale oggetto di studio nel laboratorio dove ho svolto la mia attività di ricerca. Gli esperimenti di Ca2+ imaging hanno permesso, oltre a quanto già descritto, di osservare incrementi nella concentrazione intracellulare di Ca2+ degli astrociti in risposta agli stimoli di KCl. Gli astrociti possono sostenere ed amplificare la trasmissione eccitatoria glutamatergica tramite rilascio di glutammato che agisce specificamente sui recettori NMDA; il rilascio di glutammato e di altre sostanze da parte degli astrociti è indotto da innalzamenti nella [Ca2+]int, causati a loro volta dal rilascio di diversi neurotrasmettitori (tra cui il glutammato) da parte dei neuroni. Per verificare se la comunicazione reciproca tra neuroni ed astrociti possa essere coinvolta nell’induzione e nella propagazione della CSD, la soglia e la velocità della CSD sono state misurate prima e dopo l’inibizione degli aumenti di Ca2+ intracellulare tramite applicazione di acido ciclopiazonico (CPA, 50 µM), in grado di svuotare gli stores di Ca2+ intracellulari senza influenzare la risposta dei neuroni al KCl. L’applicazione di CPA non influenzava né la soglia di induzione della CSD, né la velocità di propagazione sia nei topi WT che nei topi KI. Questi risultati suggeriscono che l’intercomunicazione tra neuroni ed astrociti non sia rilevante per l’induzione e la propagazione della CSD. La combinazione di Ca2+ imaging e patch clamp ha permesso l’osservazione, in assenza di stimolazione esterna, di attività spontanea che avviene normalmente nei networks neurali della neocorteccia; tale attività si presenta come oscillazioni lente tra periodi di depolarizzazioni indotte da attività sinaptica associate all’insorgenza di potenziali d’azione (up-states) e tra altri periodi in cui l’attività sinaptica diminuisce ed il firing scompare (down-states). Allo stesso tempo è stato possibile osservare la presenza di intense oscillazioni spontanee nella [Ca2+]int degli astrociti. Per verificare se la comunicazione reciproca tra neuroni ed astrociti potesse essere coinvolta nella generazione o nella modulazione dell’attività spontanea neuronale di network, tali oscillazioni spontanee degli astrociti sono state soppresse tramite l’applicazione di CPA. In presenza di CPA gli up-states neuronali erano ancora presenti sia nei topi WT, che nei KI, tuttavia nel primo caso si assisteva ad una riduzione significativa nella frequenza degli up-states (41 ± 3%, p = 0.0001), non riscontrabile nel caso dei topi KI (11 ± 6%, p = 0.12). Questi risultai preliminari sono in accordo con un possibile ruolo dell’intercomunicazione tra neuroni ed astrociti nell’attività spontanea dei network neuronali