A FRET-based genome wide high content screen identifies a novel role for the Parkinson's disease gene LRRK2 as modulator of endoplasmic reticulum-mitochondria tethering

La comunicazione tra organelli cellulari è una caratteristica fondamentale delle cellule eucariotiche ed esercita un ruolo fondamentale in molti processi cellulari. Uno dei processi di comunicazione tra organelli cellulari tra i più caratterizzati è quello dovuto ai siti di contatto tra le membrane di mitocondri e reticolo endoplasmatico (ER). Anche noti come "Mitochondria-associated ER membranes" (MAMs) o "Mitochondria-ER contact sites" (MERCs), la loro esistenza è stata scoperta 50 anni fa tramite studi di microscopia elettronica, ma il loro significato funzionale è iniziato ad emergere solo alla fine degli anni 90 quando è stato dimosdtrato il ruolo dei MERCs nello scambio di calcio dall'ER. Nonostante l'importanza di questi siti di contatto tra organelli sia in fisiologia sia in patologia, solo poche proteine coinvolte nel mantenimento strutturale della distanza tra i due organelli sono state finora identificate nei mammiferi. Mitofusina2 (MFN2) è stato il primo "tether" strutturale ad essere identificato. E' stato rilevato che MFN2 è localizzata sia nella membrana mitocondriale esterna (OMM) sia sulla superficie citosolica dell'ER ed ' in grado di formare intrazioni omo- ed eterotipiche con MFN1, mantenendo quindi la distanza tra i due organelli. Poiché una residua giustapposizione tra i due organelli è stata osservata in cellule MFN2-/-, ulteriori proteine che esercitano questo ruolo devono esistere. Per identificarle, abbiamo stabilito un protocollo ed eseguito due repliche di uno screening genomico su larga scala in fibroblasti embrionali di topo (MEF). Per eseguire questo screening, abbiamo sfruttato un biosensore basato sulla FRET, dove la proteina fluorescente CFP fusa con il dominio funzionale FRB e la proteina fluorescente YFP fusa con il dominio funzionale FKBP vengono fatte localizzare rispettivamente all'ER (grazie alla sequenza di segnale Sac1) ed ai mitocondri (grazie alla sequenza di segnale Akap1) (Csordas G. et al., 2010). Abbiamo modificato questo costrutto inserendo tra i cDNA delle due proteine il peptide autocatalitico Tav2A per ottenere un singolo mRNA e quindi l'espressione equimolare delle due proteine. I domini funzionali FKBP e FRB sono in grado di eterodimerizzare con l'aggiunta di Rapamicina, permettendo così la misurazione non solo dei livelli di giustapposizione basale tra i due organelli, ma anche del massimo livello di contatti che possono avvenire in una cellula. Abbiamo chiamato questo nuovo costrutto FRET ER-mitochondria probe (FEMP). Le caratteristiche uniche del FEMP ci consentono didiscriminare tra le proteine il cui ruolo è quello di mantenere i due organelli vicini, chiamate "tethers", e proteine che invece tengono i due organelli più distanti, definiti "spacers". Le immagini ottenute dallo screening sono state analizzate e sono stati calcolati due indici, chiamati "basal MERC index" e "maximum MERC index", che rappresentano rispettivamente il livello di contatti osservabili in qualsiasi momento in una cellula e il massimo livello di contatti possibile. A seguito di un'analisi delle immagini automatizzata e di un'analisi statistica effettutata su ~10,000 geni, dopo un processo di selezione abbiamo identificato 205 geni come "tethers" (geni che una volta eliminati aumentano la distanza tra i due organelli) tra mitocondri e ER e 59 geni come "spacers" (geni che una volta eliminati diminuiscono la distanza tra i due organelli) che influenzano sia il basal sia il maximum MERC index in entrambe le repliche. Inoltre, sono stati identificati 625 tethers e 696 spacers che influenzano solo il basal MERC index; e 519 tethers e 67 spacers che modificano solo il maximum MERC index. Analisi delle classi di proteine presenti in questi tre gruppi tramite Panther ha rivelato sia classi di proteine il cui ruolo in questo processo era noto, sia nuove classi di proteine il cui ruolo nella comunicazione tra ER e mitocondri deve ancora essere esplorato. Analisi della localizzazione cellulare per identificare proteine localizzate sia nell'ER sia nei mitocondri delle liste di geni esposte in precedenza, ha rivelato l'esistenza di 13 proteine tra i tethers e gli spacers comuni, 30 proteine che influenzano solo il basal MERC index e 16 proteine che influenzano solo il maximum MERC index localizzate in entrambi gli organelli. Una delle proteine presente nell'ultimo gruppo è "Leucine Rich Repeat Kinase 2" (LRRK2) che abbiamo ulteriormente caratterizzato come tether tra ER e mitocondri. Esperimenti di frazionamento cellulare dimostrano che LRRK2 è localizzata principalmente nelle MAMs. Come previsto per un tether, il livello di prossimità tra ER e mitocondri, misurato tramite FEMP, sono diminuiti in MEF LRRK2-/-. La prossimità tra i due organelli è pienamente recuperata dalla reintroduzione in MEF LRRK2-/- della proteina WT, ma non dei mutanti associati alle forme di Parkinson familiare. In conclusione, abbiamo sviluppato un nuovo metodo per determinare la prossimità tra ER e mitocondri e abbiamo utilizzato questa tecnologia per eseguire due repliche di uni screening gnomico su larga scala identificando nuovi componenti strutturali dei contatti tra mitocondri e ER.