Set up and optimization of a tandem mass spectrometry procedure for enzymatic assays of lysosomal storage disorders and feasibility evaluations for a newborn screening program

Le malattie da accumulo lisosomiale (LSD) rappresentano un gruppo di circa 50 disordini genetici, dovuti principalmente al deficit di specifiche idrolasi con conseguente accumulo di substrati non degradati nei lisosomi di organi e tessuti. Le LSD sono malattie molto complesse, gravemente debilitanti o letali, caratterizzate da un’estrema variabilità per quanto riguarda età di esordio, sintomatologia e rapidità di decorso clinico. Pur essendo singolarmente rare, esse presentano un’incidenza complessiva stimata di 1:1500-7000 nati vivi. Le principali terapie a disposizione, oltre alle cure palliative, sono la terapia enzimatica sostitutiva (ERT) e il trapianto di cellule staminali ematopoietiche; entrambe presentano massima efficacia se iniziate precocemente, prima cioè dell’insorgenza delle principali manifestazioni cliniche. Tuttavia, spesso una diagnosi precoce non è possibile poiché i test di laboratorio vengono eseguiti solo in seguito ad un evidente sospetto clinico. Altre strategie terapeutiche in fase di trial comprendono l’enzyme enhancement therapy, la terapia da inibizione/riduzione del substrato e la terapia genica. Ad oggi inoltre, i soggetti in trattamento vengono tutti sottoposti allo stesso protocollo terapeutico; sarebbe invece opportuno riuscire a sviluppare protocolli terapeutici personalizzati andando a valutare rapidamente la biodisponibilità dell’enzima somministrato, durante il follow up dei pazienti. Entrambe queste problematiche hanno portato, negli ultimi anni, alla ricerca di nuove tecniche diagnostiche, sia adatte per l’analisi di un elevato numero di campioni, che rispondenti alla necessità di permettere una veloce stima dell’attività degli enzimi di interesse in singoli soggetti. Il dosaggio enzimatico su Dried Blood Spot (DBS) mediante spettrometria in tandem massa si è rivelato un metodo ideale per la diagnosi delle malattie lisosomiali, poiché esso si distingue per affidabilità, sensibilità, rapidità e accuratezza e consente l’analisi enzimatica multipla in un elevato numero di campioni contemporaneamente. Infine, studi recenti di screening per alcune LSD condotti sia su ampie popolazioni sia su specifici gruppi a rischio (pazienti con infarto criptogenico o con insufficienza renale) hanno riportato un’incidenza complessiva sorprendentemente elevata, oltre a diversi casi, in particolare della malattia di Fabry, di mancato riconoscimento della patologia; ciò prova come questi disordini siano stati fino ad oggi sottovalutati, e sottolinea l’importanza di una corretta e tempestiva diagnosi. Questo lavoro è dedicato alla messa a punto e all’ottimizzazione di questa nuova metodica per lo studio dell’attività enzimatica per sei malattie da accumulo lisosomiale (Pompe, Fabry, Niemann Pick A/B, Gaucher, Krabbe e Mucopolisaccaridosi di tipo I). La scelta delle patologie è stata determinata sia, per ragioni etiche, dalla disponibilità di una terapia possibile, sia dalla disponibilità dei reagenti per la MSMS da parte del CDC di Atlanta. La prima parte del lavoro è stata svolta presso il laboratorio Centogene di Vienna, e ha previsto la messa a punto dei saggi per la malattia di Gaucher e Niemann Pick A/B, che sono stati successivamente unificati in un unico test insieme ai saggi per le malattie di Pompe, Fabry e Krabbe. In seguito, uno studio incrociato tra due laboratori (il laboratorio Centogene di Vienna e un gruppo di ricerca del Wadsworth Center di NY), su più di 400 campioni ha permesso di valutare l’affidabilità e la sensibilità della tecnica utilizzata, oltre ad individuare i passaggi critici del protocollo che sarebbero stati in seguito ottimizzati. Infine, nel corso di questo progetto è stato iniziato uno studio pilota di screening neonatale in collaborazione con l’Ospedale di Szeged (Ungheria). Diecimila campioni anonimi sono stati analizzati singolarmente; i campioni che presentavano una bassa attività per uno degli enzimi di interesse sono stati ri-analizzati in duplicato e nel caso di conferma, inviati ad un terzo laboratorio (Centogene di Rostock) per l’analisi molecolare. In questo modo è stata possibile sia un’identificazione delle mutazioni nei campioni patologici, sia una valutazione della percentuale di falsi positivi. Questi lavori hanno confermato non solo l’affidabilità nell’utilizzo dei DBS come campione biologico e la sensibilità della spettrometria in tandem massa per l’analisi, ma anche la facile organizzazione e applicazione di tale metodica per progetti di screening. La seconda parte del progetto è stata svolta a Padova in collaborazione con la sezione di spettrometria di massa del Dipartimento di Pediatria. Qui è stato riprodotto il saggio multiplo per i 5 enzimi sopra citati ed è stato aggiunto inoltre il test per la Mucopolisaccaridosi di tipo I. Tenendo conto dei risultati preliminari ottenuti a Vienna il protocollo è stato così modificato: è stata ridotta al minimo la parte preparativa dei campioni, sostituita da una cromatografia liquida collegata online con lo spettrometro di massa; inoltre, tutti i parametri analitici sono stati minuziosamente ottimizzati. Lo scopo è stato quello si massimizzare la sensibilità e precisione di rilevamento degli analiti per garantire una inconfutabile discriminazione tra soggetti sani e patologici. Questa nuova metodica può essere applicata per scopi diversi: sia per lo screening di ampie popolazioni, con la possibilità di aggiungere nuovi test al pannello delle malattie screenate via via che sarà per esse disponibile una terapia, sia per una rapida valutazione della bio-disponibilità dell’enzima in singoli soggetti