Functional and molecular alterations of the enteric nervous system in murine models of gut neuropathy

L'interazione fra costituenti della parete intestinale e microflora commensale costituisce il principale artefice del mantenimento della barriera mucosale, della promozione dello sviluppo del tratto gastrointestinale (GI) e della modulazione di funzioni GI, quali motilità, secrezione, immunità mucosale e sensibilità viscerale. Un'alterata microflora è stata associata a disordini GI (malattie infiammatorie croniche intestinali, MICI o sindrome dell'intestino irritabile, IBS) mentre cambiamenti del microbiota intestinale durante le fasi dell’infanzia e dell’adolescenza, causati da infezioni o antibiotici, predispongono all'insorgenza di queste malattie. Inoltre, disfunzioni del SNE quali anomalie strutturali e/o variazioni nel contenuto di neurotrasmettitori, sono state associate all'insorgenza sia di MICI che di IBS. In questo contesto, giocano un ruolo chiave i recettori Toll-like (Toll-like receptors, TLRs), un sofisticato sistema di proteine che mediano la risposta infiammatoria contro agenti patogeni e attivano segnali benefici assicurando l'integrità tissutale in condizioni fisiologiche e patologiche. Polimorfismi nei geni che codificano i TLRs, inclusi il TLR2 ed il TLR4, sono stati associati a fenotipi diversi di malattia nei pazienti affetti da disordini GI. In questo studio sono state caratterizzate le alterazioni strutturali e funzionali del SNE murino indotte da i) anomalie nella composizione del microbiota, ii) cambiamenti nel segnale dell’immunità innata, mediato dai recettori TLR2 e 4 ed implicato nel riconoscimento di profili molecolari derivanti dalla microflora intestinale e iii) variazioni di espressione della proteina catecol-O-metiltransferasi (COMT), implicata nel turnover di neurotrasmettitori del SNE e del sistema nervoso centrale, come la dopamina e altre catecolamine. Tramite studi funzionali e strutturali in vitro utilizzando topi maschi C57BL/6J WT e TLR2-/- di pari età (21±5 giorni di età) è stata evidenziata la presenza di alterazioni significative della contrattilità intestinale e dell'architettura dell'ENS nei preparati di ileo provenienti dai topi geneticamente modificati. Una volta dimostrato che la delezione del gene codificante per il recettore TLR2 determinava anomalie strutturali e funzionali nel SNE, è stato valutato se il segnale mediato dal TLR2 derivasse da cellule immunocompetenti ematopoietiche oppure dalle diverse popolazioni cellulari esprimenti questo recettore e residenti nell’intestino, come i neuroni, la glia, le cellule muscolari lisce e le cellule endoteliali. Sono stati così generati topi chimera cioè portatori di cellule geneticamente distinte originate da topi 'donatori' WT e TLR2-/- di pari sesso ed età, quali: i) topi WT che hanno ricevuto il midollo osseo da topi WT donatori (WT?WT), ii) topi WT che hanno ricevuto il midollo osseo da topi TLR2-/- donatori (TLR2-/-?WT), iii) topi TLR2-/- che hanno ricevuto il midollo osseo da topi TLR2-/- donatori (TLR2-/-?TLR2-/-), iv) topi TLR2-/- che hanno ricevuto il midollo osseo da topi WT donatori (WT?TLR2-/-). Esperimenti di contrattilità condotti nei topi chimera hanno dimostrato che le alterazioni della funzione neuromuscolare non sono dipendenti dal segnale TLR2 mediato dalle cellule ematopoietiche. Pertanto la valutazione dei topi deficienti per il TLR2 ha evidenziato il ruolo primario di questo recettore nel conservazione dell'integrità strutturale e funzionale del SNE. Al fine di approfondire il ruolo dell'asse TLR2-microbiota nell’omeostasi del SNE e della muscolatura liscia enterica è stato messo a punto un modello animale di deplezione di microbiota intestinale attraverso la somministrazione intragastrica di 4 antibiotici, ampicillina (100 mg/kg), metronidazolo (100 mg/kg), neomicina (100 mg/kg) e vancomicina (50 mg/kg) due volte al giorno per 14 giorni a topi WT adolescenti (21±5 giorni di età; topi ABX). Da una prima valutazione il trattamento antibiotico ha determinato l’aumento delle dimensioni e del peso del cieco, caratteristica già osservata in topi adulti germ-free, ossia privi di microrganismi dalla nascita. Questa condizione, già evidenziata in soggetti affetti da IBS, sembra dovuta ad un ritardato svuotamento delle feci dal cieco ingrossato, ad indicare una compromissione della motilità dimostrata da un ritardato transito a livello del colon. Successivamente gli studi funzionali in vivo hanno rivelato una diminuzione significativa del transito gastrointestinale, accompagnata da alterazioni nella frequenza del pellet fecale e nel contenuto di acqua nelle feci. Tali risultati hanno evidenziato che il trattamento antibiotico determina una riduzione della motilità intestinale con possibili effetti a livello della barriera mucosale. In seguito, analisi immunoistochimiche su preparati di ileo provenienti da topi ABX hanno evidenziato anomalie nella distribuzione ed espressione della proteina marcatore pan-neuronale HuC/D, della proteina gliale strutturale GFAP (glial fibrillary acidic protein) e della subunità ? della proteina S-100, marcatore gliale nucleare e citoplasmatico in grado di legare il calcio. Tali osservazioni sembrano confermare come la deplezione del microbiota intestinale possa influenzare l'integrità della rete neuronale e gliale enterica. Data l’importanza di una corretta composizione del microbiota commensale nel mantenimento della rete nervosa e del codice neurochimico del SNE è stata valutata la funzione intestinale in vitro mediante esperimenti di contrattilità utilizzando la tecnica dell'organo isolato su segmenti di ileo provenienti da topi CNTR e ABX. Queste analisi hanno evidenziato anomalie nell’attività contrattile neuromuscolare associate dopo trattamento antibiotico sottolineando l’importanza di una corretta composizione del microbiota nel mantenimento dell’attività motoria enterica. In parallelo, è stato ulteriormente dimostrato il ruolo primario del segnale mediato dal TLR2 nel controllo dell’attività neuromuscolare, saggiando l’effetto del Pam3CSK4, ligando del TLR2, sulla disfunzione contrattile indotta dalla terapia antibiotica. La somministrazione di Pam3CSK4 per via intraperitoneale, durante la seconda settimana di trattamento antibatterico ha prevenuto l’entità del danno motorio intestinale, a sostegno della presenza di un dialogo tra il microbiota ed TLR2, fondamentale per la modulazione della funzione neuromuscolare. Per evidenziare l'importanza dell'asse microbiota-TLR2-SNE nel mantenimento della funzione intestinale e nello sviluppo del SNE è stato somministrato l'OxPAPC, inibitore dei segnali mediati sia da TLR2 che da TLR4, a topi WT adolescenti per via sottocutanea per 7 giorni consecutivi. Il trattamento con OXPAPC ha causato un’alterazione significativa della risposta neuromuscolare sia recettore-mediata che non nei topi trattati rispetto al controllo, già evidenziata in topi deficienti per il recettore TLR2, confermando l’importanza del segnale mediato da tali recettori nell'assicurare l’integrità funzionale e strutturale del SNE durante l'adolescenza. In parallelo sono state studiate le vie di neurotrasmissione, coinvolte nella sensibilità viscerale, nel modello animale di deplezione della microflora, analizzando l’espressione genica di GluN1, subunità funzionale del recettore NMDA del glutammato. E’ stato osservato un incremento dei livelli di mRNA di GluN1 nel plesso mienterico dei preparati di ileo provenienti dai topi ABX, evidenziando gli effetti di alterazioni della composizione del microbiota intestinale sulla sensibilità viscerale. Infine è stato approfondito il ruolo dell’asse ‘cervello-intestino’ attraverso la valutazione strutturale e funzionale del SNE in un modello animale di malattie psichiatriche, caratterizzato dalla riduzione genica di COMT, enzima responsabile della degradazione delle catecolamine. In animali di sesso femminile è stato dimostrato che gli aumentati livelli di catecolamine, dovuti alla riduzione genica di COMT, determinano alti livelli di NO e sofferenza neuronale con conseguente accelerato transito GI e sensibilità viscerale, a confermare il ruolo primario di polimorfismi funzionali di COMT in donne affette da IBS.