Studies on polymer conjugation of therapeutic proteins and peptides

Sin dall’introduzione dell’insulina ricombinante, nel 1979 e grazie ai progressi della biotecnologia farmaceutica, proteine e peptidi terapeutici hanno raggiunto una significativa importanza nel trattamento di molte patologie e rappresentano l’unica opzione terapeutica. Questo crescente successo non è comunque, privo di potenziali ostacoli come una breve emivita, una facile degradazione enzimatica e l’immunogenicità. La PEGhilazione, ovvero il legame di catene di polietilenglicole (PEG) a molecole bioattive, è oggigiorno una delle più comuni strategie usate per superare i limiti inerenti alle proteine terapeutiche. Gli studi riportati in questa tesi di dottorato sono focalizzati sulla progettazione e preparazione di coniugati di proteine e peptidi terapeutici con carrier polimerici ottimizzati, in modo da ottenere migliori prestazioni dell’entità coniugata, sia dal punto di vista del profilo farmacocinetico che farmacodinamco. Le proteine e il peptide usati in questo lavoro sono G-CSF, o fattore di crescita umano ricombinante stimolante la formazione di colonie granulocitiche, hGH, o ormone della crescita umano ricombinante e KR14, un peptide anti-HIV. G-CSF, hGH e KR14, a causa del loro basso peso molecolare, sono rapidamente eliminati dall’organismo e sono soggetti a degradazione proteolitica, con conseguente bassa biodisponibilità e necessità di somministrazioni frequenti. La prima parte di questa tesi di dottorato è focalizzata su: i) PEGhilazione enzimatica via transglutaminasi di G-CSF a PEG non carichi e a nuovi PEG multicarbossilati, ii) caratterizzazione e studi di stabilità dei coniugati ottenuti, iii) studi farmacocinetici in ratti, per avere un confronto tra i coniugati e la proteina nativa come riferimento. Lo scopo di questo studio è stato quello di testare i PEG multicarbossilati per valutare il contributo delle cariche negative sul prolungamento dell’emivita della proteina, grazie alle proprietà di selezione della carica della barriera di filtrazione del glomerulo. La PEGhilazione con PEG ad alto peso molecolare, aumentando il volume idrodinamico della proteina, riduce la velocità di filtrazione glomerulare, ma può costituire un impedimento sterico e ridurre l’affinità di legame tra la proteina terapeutica e il suo target. Il concetto di selettività della carica della barriera di filtrazione glomerulare può essere sfruttato con i nuovi polimeri polianionici, che, con un basso peso molecolare, possono mantenere un profilo farmacocinetico della proteina esteso e raggiungere anche una migliore conservazione dell’attività della proteina. I PEG polianionici usati per questo lavoro sono stati i) H2N-PEG5k-(COOH)7, un PEG eterobifunzionale che è stato derivatizzato ad un’estremità con unità di acido β-glutammico e che possiede 7 gruppi carbossilici e ii) H2N-PEG3.4k-b-PLE50, un polimero polianionico lineare costituito da PEG legato a PLE, il quale possiede i gruppi pendenti ϒ-carbossilici dei monomeri dell’acido glutammico. Oltre a questi due PEG multicarbossilati, sono stati usati anche due PEG non carichi, di peso molecolare 5 e 20 kDa. Dopo PEGhilazione, tutti i coniugati di G-CSF sono stati caratterizzati tramite MALDI-TOF, SDS-PAGE e dicroismo circolare e gli studi farmacocinetici sono stati condotti in ratti. La seconda parte di questa tesi di dottorato si focalizza sul confronto dell’attività biologica (stimolazione della crescita somatica) di tre coniugati dell’ormone della crescita che si differenziano per il carrier polimerico (multicarbossilato o neutro) e per il sito di coniugazione del polimero. Lo scopo di questo studio è stato valutare se la stabilità della proteina e il riconoscimento proteina/recettore sono stati influenzati dal sito di coniugazione del polimero e verificare l’impatto di carrier polianionici sul profilo farmacodinamico della proteina. La coniugazione del polimero multicarbossilato, acido (poli)glutammico, risulta in un aumento della carica negativa netta del coniugato. Sulla base del concetto di selettività della carica della filtrazione glomerulare, polimeri polianionici aventi pesi molecolari relativamente bassi, possono fornire un’estensione dell’emivita di una proteina simile a quella ottenuta con polimeri neutri di alto peso molecolare. Due diverse forme di hGH mono-PEGhilato in maniera sito-specifica sono state preparate sfruttando una PEGhilazione enzimatica (PEG-Gln141-hGH) via tranglutaminase (TGase) e una PEGhilazione chimica all’N-terminale (PEG-Nter-hGH), usando PEG neutri di peso molecolare 20 kDa. Interessante è il fatto che i coniugati hanno mostrato una stabilità termica aumentata e la capacità di refold dopo denaturazione termica. Il terzo monoconiugato di hGH è stato preparato tramite coniugazione all’N-terminale, usando un acido (poli)glutammico con 50 unità di acido glutammico e con una funzione aldeidica ad un’estremità (PLE50ald). I monomeri di acido glutammico conferiscono al polimero la caratteristica di polianionico. hGH-PLE50ald è stato caratterizzato tramite MALDI-TOF, SDS-PAGE, dicroismo circolare e gli studi farmacocinetici sono stati condotti in ratti. La bioattività di una dose singola di hGH-PLE50ald, PEG-Gln141-hGH e PEG-Nter-hGH si è dimostrata simile o migliore rispetto a iniezioni giornaliere di hGH, misurando la crescita somatica in ratti ipofisectomizzati. La terza parte di questo lavoro tratta di: sintesi e caratterizzazione di KR14 e coniugazione di KR14 a PEG20kDa-Mal, studi farmacocinetici del coniugato in topi e studi di affinità di legame tramite SPR. Una parte di questo lavoro è stata sviluppata al Dipartimento di Biochimica e Biologia Molecolare presso Drexel University College of Medicine a Philadelphia, sotto la supervisione del Professor Irwin Chaiken, il cui laboratorio è focalizzato sulla progettazione e realizzazione di farmaci peptidici che inibiscono l’entrata del virus HIV-1 nelle cellule target. Questo passaggio iniziale di entrata del virus è caratterizzato dal legame della glicoproteina di membrana gp120 al recettore cellulare CD4 e al co-recettore. Il peptide KR14 proviene da una famiglia già nota di peptidi, modificati con triazolo, che ha un considerevole potenziale terapeutico, esibendo alta affinità di legame per la gp120 e inibendo le interazioni di gp120 con CD4 e con il surrogato del co-recettore mAb17b. KR14 è stato progettato in modo da comprendere un gruppo tiolico libero in posizione 16, che è stato utilizzato per la PEGhilazione selettiva con un PEG-maleimide di 20 kDa. L’identità e la purezza del coniugato sono state confermate tramite SEC-HPLC e MALDI-TOF. Gli studi farmacocinetici in topi hanno dimostrato che la PEGhilazione ha prolungato l’emivita del peptide da 44 minuti a 289 minuti. Ancora più interessante, il coniugato non ha mostrato la tipica perdita di bioattività, comune alla maggior parte dei farmaci PEGhilati. Infatti gli studi SPR hanno dimostrato che PEG-KR14 è solo 1,5, 1,6 volte meno attivo di KR14, un risultato rilevante. In conclusione gli studi di questa tesi di dottorato hanno dimostrato ulteriormente il potenziale della PEGhilazione nella veicolazione di proteine e peptidi. Anche se la PEGhilazione è già una tecnologia matura che ha portato diversi prodotti in uso clinico, abbiamo dimostrato che ci sono ancora motivi per l’implementazione e le nuove scoperte, perseguendo anche la selettività di carica della filtrazione renale e non solo la selettività per dimensioni, come fatto finora in questo campo.