The role of mitotic slippage, USP1-regulated apoptosis, and multiple treatments in the action of temozolomide in glioblastoma multiforme

Introduzione. La temozolomide (TMZ) è un farmaco alchilante frequentemente utilizzato nella chemioterapia dei gliomi. Nonostante molti aspetti siano ancora enigmatici, il suo meccanismo di azione generale è ben noto. La TMZ induce metilazione della guanina nel DNA (O6MeG) che, in assenza di riparazione ad opera di O6-methylguanine methyltransferase (MGMT), si appaia con una timina innescando un ciclo futile di riparazione e risintesi. Ne risultano rotture del DNA a doppio filamento (DSBs) che attivano i componenti del checkpoint in G2, e le cellule con DNA 4N si accumulano e arrestano in G2 per parecchi giorni. Le cellule muoiono poi per senescenza, necrosi, o catastrofe mitotica, mentre l’apoptosi è stata a lungo negata. Inoltre non è chiaro l’effetto di somministrazioni multiple di TMZ sull’arresto in G2/M e sull’induzione di apoptosi. La riparazione delle lesioni al DNA causate dai farmaci alchilanti richiede la monoubiquitinazione di PCNA e FANCD2; la perdita di una delle due proteine o l’inibizione della loro monoubiquitinazione potenzia la tossicità indotta dagli agenti metilanti. USP1 è una idrolasi in grado di rimuovere la monoubiquitina da PCNA e FANCD2, e per questo può essere un regolatore della risposta alla TMZ. Materiali e metodi. Sono state utilizzate le linee cellulari U87, U251 (TMZ-sensibili, bassi livelli di MGMT) e GBM8 (TMZ-resistenti, alti livelli di MGMT). Il protocollo di trattamento prevede 1, 2 o 3 dosi di TMZ 100μM per 3 ore. La progressione nel ciclo cellulare è stata studiata sia con FACS sia con una nuova tecnica di microscopia time-lapse in tempo reale (FUCCI, Fluorescent Ubiquitination-based Cell Cycle Indicator), mentre l’apoptosi è stata verificata al citofluorimetro con il metodo dell’annessina V-Propidio Ioduro. Per verificare il possibile ruolo di USP1 nell’azione della TMZ, dopo aver esaminato su databases di mRNA microarray l’espressione di USP1 nei glioblastomi, le cellule sono state transfettate con RNA a interferenza contro USP1 o di controllo. È quindi stato studiato l’effetto della soppressione dei livelli di USP1 sull’arresto in G2/M, la morte cellulare e la clonogenicità indotte dalla TMZ. Risultati. Trattamenti multipli con TMZ riducono la clonogenicità delle cellule di glioma sensibili al farmaco in maniera significativamente superiore rispetto al trattamento singolo, non modificano l’entità dell’arresto in G2, mentre inducono un significativo aumento dell’apoptosi in particolare in fase tardiva. L’analisi in time-lapse con il sistema FUCCI ha mostrato che le cellule sensibili alla TMZ subiscono un arresto in G2 inferiore alle 48 ore. Inoltre, in presenza di attivazione del checkpoint in G2, replicano il DNA ma non si dividono, rientrando nel ciclo cellulare in G1 e dando origine a cellule poliploidi. La soppressione dei livelli di USP1 da sola ha effetti minimi sulla progressione del ciclo cellulare e sulla morte cellulare sia nelle cellule sensibili che in quelle resistenti alla TMZ. Allo stesso modo, la soppressione dei livelli di USP1 non altera l’entità dell’arresto in G2/M indotto dalla TMZ. Tuttavia il knockdown di USP1 sorprendentemente incrementa la perdita di clonogenicità indotta dalla TMZ sia nelle cellule sensibili che in quelle resistenti. A differenza delle cellule di controllo in cui USP1 è stato soppresso, o di quelle con normale espressione di USP1 e trattate con TMZ, le cellule USP1-knockdown trattate con TMZ subiscono un’alta percentuale di morte per apoptosi. Conclusioni. I risultati dei nostri studi hanno mostrato che il trattamento delle cellule di glioma con TMZ può indurre apoptosi, e che questa è evidenziabile già dopo 3 giorni, sebbene diventi significativa solo tardivamente. Trattamenti multipli non modificano l’entità dell’arresto in G2, ma aumentano significativamente l’apoptosi. Inoltre gli studi di time-lapse permettono di proporre un nuovo meccanismo di azione per la TMZ, diverso da quello finora comunemente accettato, con significative implicazioni sullo sviluppo della resistenza al farmaco. La deubiquitinasi USP1, piuttosto che impedire l’attivazione di PCNA e FANCD2 e inibire in questo modo la riparazione del danno al DNA indotto dagli agenti metilanti, come indirettamente suggerito da studi precedenti, sembra invece sopprimere vie apoptotiche latenti e proteggere le cellule dall’apoptosi indotta dalla TMZ. La soppressione di USP1 o delle vie controllate da USP1 può rappresentare un modo per incrementare il potenziale citotossico della TMZ e per sensibilizzare GBM prima resistenti