The endoplasmic reticulum-mitochondria coupling: role of Presenilin-2

La malattia di Alzheimer (AD) è la forma più frequente di demenza. Una piccola percentuale dei casi è ereditaria (Familial AD, FAD) ed è dovuta a mutazioni autosomiche dominanti in tre geni, che codificano per la Proteina Precursore dell’Amiloide (APP), per Presenilina-1 (PS1) e per Presenilina-2 (PS2). Le mutazioni in queste proteine causano alterazioni nella maturazione di APP da parte di un enzima (detto У-secretasi) che contiene alternativamente PS1 o PS2, portando così ad un aumento del rapporto tra Aß42 e Aß40, che sono i due principali peptidi prodotti in seguito al taglio di APP. Questo a sua volta induce un aumento della deposizione delle “placche amiloidi”, uno dei principali marcatori isto-patologici dell’AD. La generazione del peptide Aß42, dei suoi oligomeri e delle placche amiloidi costituisce il core dell’ipotesi patogenica ad oggi più accreditata per spiegare l’insorgenza della malattia di Alzheimer, ossia “l’ipotesi della cascata amiloide”. PS1 e PS2 sono proteine omologhe ubiquitarie con 9 domini trans-membrana, principalmente localizzate nelle membrane del reticolo endoplasmatico (ER), dell’apparato del Golgi, degli endosomi e in membrana plasmatica. Oltre a costituire il nucleo catalitico della У-secretasi, le preseniline possiedono anche delle attività specializzate У-secretasi indipendenti, talvolta non ridondanti tra le due proteine. Per esempio, molti studi hanno evidenziato un ruolo per alcune mutazioni nelle Preseniline associate a FAD nell’alterazione dell’omeostasi del calcio (Ca2+) intracellulare. Il Ca2+ è un secondo messaggero chiave per le cellule e regola numerose funzioni cellulari; pertanto, alterazioni nelle dinamiche di questo ione possono essere estremamente dannose per le cellule e sono state proposte essere alla base di diverse patologie neurodegenerative, tra cui in particolare l’AD. Sebbene sia stata ampiamente supportata da vari gruppi, l’ipotesi dell’alterazione dell’omeostasi del Ca2+ alla base dell’insorgenza dell’AD non è mai stata completamente accettata, dal momento che alcuni dati sono chiaramente discordanti, soprattutto per quanto riguarda alcune mutazioni in PS2. Nel nostro laboratorio, è stato in precedenza dimostrato che diverse mutazioni associate a FAD in PS2, ma non in PS1, riducono il contenuto di Ca2+ nell’ER e nell’apparato del Golgi, principalmente attraverso una inibizione della pompa SERCA. Negli ultimi anni, crescenti evidenze hanno dimostrato l’esistenza di un continuo flusso di informazioni tra l’ER e i mitocondri, due organelli la cui interrelazione modula aspetti chiave nella pato-fisiologia delle cellule, dal metabolismo lipidico alla regolazione dell’omeostasi del Ca2+, fino alla morte cellulare. Diverse proteine sono state coinvolte nel mantenimento di una appropriata distanza tra l’ER e i mitocondri, permettendo così una corretta organizzazione delle loro reciproche interazioni e dello scambio di Ca2+ tra di essi. Tra queste è stato proposto che Mitofusina-2 (Mfn2), localizzata sia sulla membrana mitocondriale esterna (OMM) che, in minore percentuale, sulla superficie dell’ER, moduli il tethering fisico tra i due organelli, attraverso delle interazioni di tipo omotipico a livello delle “membrane associate ai mitocondri” (MAM). Anche PS1 e PS2 sono arricchite a livello delle MAM: nel nostro laboratorio abbiamo recentemente dimostrato che PS2, ma non PS1, modula la vicinanza fisica tra l’ER e i mitocondri, influenzando così lo scambio di Ca2+ tra di essi. Nel lavoro presentato in questa tesi, abbiamo studiato attraverso quale meccanismo molecolare PS2 è in grado di influenzare il tethering, prendendo in considerazione la possibilità che l’effetto di PS2 dipenda in qualche modo dalla presenza di Mfn2. Attraverso esperimenti incrociati di ablazione e ricostituzione genetica, abbiamo dimostrato che per modulare l’accoppiamento tra i due organelli PS2 necessita dell’espressione di Mfn2, e viceversa. Al contrario, le loro proteine omologhe PS1 e Mitofusina-1 (Mfn1) non sembrano essere coinvolte in queste funzioni. Evidenze funzionali e biochimiche indicano che PS2 (wt e FAD) interagisce fisicamente attraverso il suo esteso dominio citosolico con Mfn2 presente in entrambi i lati delle MAM, probabilmente formando o stabilizzando un triplice complesso formato da PS2, da Mfn2 sull’ER e da Mfn2 sulla OMM. I risultati qui esposti suggeriscono che PS2 e Mfn2 cooperano e necessitano reciprocamente una dell’altra per mantenere il tethering tra ER e mitocondri, mentre invece PS1 e Mfn1 non sono necessarie. Per spiegare l’effetto potenziato sull’accoppiamento tra i due organelli delle forme mutate di PS2 associate a FAD, rispetto alla proteina wt, abbiamo effettuato dei sub-frazionamenti proteici a partire da cervelli di topi. Ciò che abbiamo osservato è che nei topi transgenici (tg), che portano la mutazione associata a FAD PS2-N141I, PS2 è fortemente arricchita a livello delle MAM, rispetto ai controlli. Inoltre, nei topi transgenici anche Mfn2 è leggermente arricchita nelle MAM, il che potrebbe forse spiegare l’effetto più forte sul tethering delle mutazioni FAD. Il modello che proponiamo è che, essendo la PS2 mutata più arricchita nelle MAM rispetto alla forma wt, recluti più Mfn2 (interagendo con essa sia in cis che in trans) e formi più complessi PS2-Mfn2, i quali sono fondamentali per determinare l’accoppiamento tra i due organelli. Infine, l’aumentato tethering tra ER e mitocondri è stato osservato anche in fibroblasti di un paziente FAD con la mutazione PS2-N141I, ossia una condizione in cui la proteina mutata esercita la sua funzione indipendentemente da qualsiasi possibile artefatto legato alla sua sovra-espressione. Ulteriori studi saranno necessari per capire quale meccanismo favorisce l’accumulo di PS2 mutata nelle MAM e se l’aumentata vicinanza tra ER e mitocondri, osservata in presenza delle mutazioni in PS2 associate a FAD, sia in qualche modo coinvolta nell’insorgenza o, quantomeno, nella progressione della malattia di Alzheimer