Pathogenetic Mechanisms of Collagen Type VI-Related Muscular Dystrophies

L’obiettivo di questa tesi è determinare i meccanismi molecolari coinvolti nella progressione di un sottogruppo specifico di malattie neuromuscolari: le distrofie muscolari congenite causate da deficit di collagene di tipo VI. Questo gruppo di distrofie comprende un ampio spettro di disordini caratterizzati da un ampio spettro di manifestazioni cliniche: dalla più grave distrofia muscolare congenita di Ulrich (UCMD) alla più moderata miopatia di Bethlem” (BM). Sia UCMD che BM si manifestano alla nascita o nel prima infanzia con ipotonia e debolezza muscolare progressiva, contrazioni delle articolazioni prossimale e iperelasticità delle articolazioni distali. Individui affetti da UCMD iniziano a deambulare con un ritardo di 2 anni rispetto ad individui sani, e la capacità deambulatoria viene poi persa nuovamente. Individui affetti da BM, invece, conservano la capacità di ambulare e solo pochi necessitano di sussidi. Dal punto di vista genetico, UCMD e BM sono causate da mutazioni che possono colpire uno o più geni codificanti le tre molecole del collagene di tipo VI. Tali mutazioni possono agire in modo dominante o recessivo. Morfologicamente le biopsie muscolari di pazienti affetti da UCMD e BM sono caratterizzate da atrofia muscolare, fibrosi, rigenerazione e degenerazione delle fibre muscolare, evidenziata dalla presenza di aree necrotiche. Nel presente lavoro, abbiamo effettuato un’analisi sistematica di 22 biopsie muscolari ottenute da pazienti affetti da COL6RD e 14 biopsie muscolari ottenuti da controlli sani di età corrispondente, che sono state suddivise in base al grado di atrofia muscolare e fibrosi. Questa classificazione è stata effettuata usando un algoritmo originale per l’analisi automatica di preparazioni istologiche, ed ha generato 3 gruppi, COL6RD-1, COL6RD-2 and COL6RD-3, di gravità istologica crescente. Le stesse biopsie sono state sottoposte a microarray e RNA-Seq ed hanno rivelato andamenti di espressione genica in forte correlazione con i gruppi definiti secondo secondo i preparati istologici, sottolineando la chiara divisione tra le biopsie muscolari di individui affetti da COL6RD e controlli. L’analisi in silico dell’espressione genica ha successivamente rivelato TGFβ1 come il maggior responsabile dei cambiamenti istologici in COL6RD e, verosimilmente, dei processi patofisiologici sottostanti. Il coinvolgimento di TGFB1 è stato ulteriormente confermato dall’ upstream regulator analysis, validazione di geni target downstream tramite qRT-PCR, e di proteine effettrici tramite western blot e immunofluorescenza. I dati ottenuti tramite RNA-Seq hanno rivelato un ulteriore livello di regolazione dell’espressione genica attuato tramite splicing alternativo. Abbiamo identificato 43 geni aventi più di una variante la cui espressione è significativamente diversa tra biopsie muscolari di COL6RD e controlli sani. Nello specifico, Decorin è il gene con il maggior numero di isoforme originate da splicing alternativo. Nel complesso, questo studio suggerisce che i diversi stadi istologici di COL6RD sono caratterizzati dallo stesso profilo di espressione genica, che coinvolge prevalentemente l’aumento di componenti della matrice extracellulare, anche in mancanza di evidenze istologiche di fibrosi, e la diminuzione di prodotti di geni muscolo-specifici. I nostri risultati suggeriscono anche che ci siano pathway molecolari TGFβ1-dipendenti che agiscono da principali regolatori dei cambiamenti patologici a livello del muscolo scheletrico. Inoltre, le biopsie muscolari provenienti da pazienti affetti da COL6RD sono caratterizzate da un aumento delle isocrone geniche generate da splicing alternativo, soprattutto per geni coinvolti nella produzione e nel mantenimento della matrice extracellulare.