T7-CYANO - Production and development of a Synechocystis strain useful for inducible membrane protein expression and controlled antisense RNA synthesis

Si ritiene che i cianobatteri siano stati i primi organismi in grado di produrre ossigeno attraverso la fotosintesi, il processo chimico che utilizza la luce solare come fonte di energia per fissare la CO2 in molecole di carboidrati. I cianobatteri sono storicamente considerati un sistema modello per lo studio dei processi fotosintetici. Più recentemente questi organismi hanno acquisito un particolare interesse anche in ambito biotecnologico, in particolare come fonte alternativa di energia, per esempio nella produzione di bioetanolo o bioidrogeno, e nella produzione di molecole utili per l' industria farmaceutica. I cianobatteri, inoltre, sono interessanti organismi da usare come ospiti per l'espressione di proteine, in particolare per quelle di membrana. Infatti, il loro abbondante sistema membranale interno (i tilacoidi) dovrebbe fornire lo spazio adeguato per la localizzazione di questo tipo di proteine e permettere quindi una maggiore produzione delle stesse. Synechocystis sp. PCC 6803 è a tutt' oggi uno dei ceppi cianobatterici più studiati ed è considerato un organismo modello per lo studio della fotosintesi. Le ragioni principali di questo suo ampio utilizzo risiedono in alcune sue caratteristiche: è spontaneamente trasformabile, puù facilmente incorporare DNA esogeno nel suo genoma mediante ricombinazione omologa ed è in grado di crescere sia in fotoautotrofia sia in eterotrofia. Tuttavia, la mancanza di elementi episomali maneggevoli anche per il clonaggio e la presenza di 10-12 copie del genoma per cellula batterica hanno finora ostacolato un suo più vasto sfruttamento. Lo scopo di questo studio è di sviluppare un ceppo di Synechocystis sp. PCC 6803 che semplifichi l' utilizzo delle tecniche del DNA ricombinante in questo organismo e che possa essere utilizzato per l'espressione inducibile di proteine. Il tool consiste in un sistema a due componenti: i) un nuovo ceppo di Synechocystis sp. PCC 6803, chiamato "T7-cyano", che ospita il gene codificante la T7 RNA polimerasi sotto il controllo di diversi promotori inducibili; ii) un set di vettori, chiamati pSEV (Synechocystis Expression Vectors), per l'introduzione stabile nel genoma di un frammento di DNA di interesse sotto il controllo del promotore T7. Il sistema è analogo al ceppo BL21 di Escherichia coli: l' induzione della T7 RNA polimerasi conduce alla trascrizione della sequenza eterologa in modo controllato. Il presente lavoro descrive il disegno sperimentale del sistema T7-cyano e i risultati preliminari conseguenti alla sua induzione. Dopo una breve introduzione sui cianobatteri (capitolo uno), nel secondo capitolo è descritto il nuovo tool cianobatterico e la costruzione di un vettore, Transformation Vector, per l'integrazione stabile del gene codificante la T7 RNA polimerasi nel genoma di Synechocystis. In questo stesso capitolo, è inoltre illustrata la costruzione della seconda componente del sistema. Questa è rappresentata da tre diversi vettori di espressione aventi diverse applicazioni: pSEV1, per l'espressione di proteine in fusione con uno Strep-tag; pSEV2, per l'espressione di proteine ricombinanti endogene o eterologhe; pSAS, per la sintesi di molecole di RNA in antisenso. La creazione e lo sviluppo del ceppo T7-cyano è riportata nel terzo capitolo. Tre diversi promotori inducibili sono selezionati per controllare l'espressione della T7 RNA polimerasi. I promotori scelti sono: Pzia, un promotore endogeno inducibile dallo zinco, Pnrs, un altro promotore endogeno inducibile da nickel e una variante del promotore Plac di Escherichia coli. Utilizzando il Transformation Vector il gene della T7 RNA polimerasi è inserito in omoplasmia nel genoma del cianobatterio. La produzione della T7 RNA polimerasi è, per la prima volta in Synechocystis, mostrata mediante analisi di immunoblotting nei ceppi con i promotori Pzia e Pnrs. Il sistema è quindi testato nell'espressione di tre differenti proteine eterologhe (capitolo quattro): la proteina fluorescente eGFP; HydA, una [FeFe]-idrogenasi proveniente dall'alga Chlamydomonas reinhardtii precedentemente espressa in Synechocystis sp. PCC 6803; e una Baeyer-Villiger monoossigenasi (BVMO) dell'alga Cyanidioschyzon merolae, già precedentemente espressa in Escherichia coli. Le sequenze codificanti le tre proteine prescelte sono clonate in uno dei vettori di espressione sviluppati, pSEV1 e pSEV2, e i vettori ottenuti sono utilizzati per trasformare i ceppi di T7-cyano. In esperimenti preliminari di induzione è confermata la trascrizione dei geni eterologhi ad opera della T7 RNA polimerasi. Inoltre attraverso immunoblotting è stata con successo rilevata l'espressione dell'enzima BVMO. Tuttavia i promotori Pzia e Pnrs, sia mediante l'analisi dei trascritti che immunoblotting, sono risultati leaky. Inoltre la bassa quantità dell'enzima BVMO prodotta suggerisce una inefficiente traduzione del gene esogeno. Nell'ultimo capitolo il sistema T7-cyano è proposto per la sintesi inducibile di RNA antisenso. Synechocystis sp. PCC 6803, infatti, possiede un numero elevato di piccoli RNA regolatori trascritti in diverse condizioni ambientali e di stress, tuttavia solo pochi RNA antisenso sono stati caratterizzati tutt'oggi. Il nuovo sistema puù quindi essere un utile tool per lo studio e la caratterizzazione di queste piccoli RNA. Inoltre una interessante applicazione sarebbe il knockdown controllato di geni endogeni. Per testare il sistema T7-cyano nella sintesi di RNA antisenso, viene scelto IsrR, uno dei pochi RNA antisenso già caratterizzato in Synechocystis sp. PCC 6803, noto down-regolatore del gene IsiA attivato in condizioni di carenza di ferro. In aggiunta è disegnato un secondo RNA antisenso contro il 5'UTR dello stesso gene IsiA. Gli esperimenti preliminari di induzione sono stati svolti presso il dipartimento di biochimica della University of Turku (Finland) nel gruppo di ricerca Molecular Plant Biology guidato dalla Prof. Eva-Mari Aro, esperta nello studio degli organismi fotosintetici. I primi risultati mostrano un fenotipo knockdown nei ceppi indotti, tuttavia maggiori esperimenti sono necessari per confermare il silenziamento del gene attraverso la sintesi di antisenso nei T7-cyano. Il lavoro di questa tesi fornisce una visione di insieme del nuovo sistema mostrando, per la prima volta, la capacità di Synechocystis sp. PCC 6803 di produrre la T7 RNA polimerasi che a sua volta è in grado di trascrivere il gene clonato a valle del promotore T7. Il lavoro ha inoltre evidenziato le due maggiori problematiche del sistema ovvero la leakiness dei promotori Pzia e Pnrs e una inefficiente traduzione del gene eterologo