CHARACTERIZATION OF THE MUTATIONAL PROFILE IN PATIENTS WITH IDIOPATHIC ERYTHROCYTOSIS

Absolute erythrocytosis is a clinical condition in which patients are characterised by increased red cells production. This condition usually becomes manifest with haemoglobin (Hb) levels above 165 g/L or 160 g/L or haematocrit (HT) above 49% or 48%, in males and in females, respectively. Polycythaemia vera (PV), a primary acquired erythrocytosis, is caused by the V617F mutation or by mutations in exon 12 of the JAK2 gene. Among the acquired forms there are also secondary erythrocytosis which frequently occurs due to appropriate or inappropriate production of erythropoietin (EPO). Congenital erythrocytosis, on the other hand, are classified as primary hereditary erythrocytosis when the patient carries mutations in the erythropoietin receptor gene (EPOR) and into secondary congenital erythrocytosis when the patients present defects in genes involved in the oxygen sensing pathway (VHL, PHD2, HIF-2α) or that cause tissue hypoxia such as mutations of the globin genes (HBB or HBA) or defects in biphosphoglycerate mutase (BPGM). In 70% of patients, the cause of their absolute erythrocytosis is not identified and a diagnosis of Idiopathic Erythrocytosis (IE) is made. Recently, HFE mutations have been found in some IE patients suggesting the possible involvement of Iron Metabolism in causes of IE. We created an ad-hoc Next Generation Sequencing (NGS) panel for the identifications of variants in fifteen genes: JAK2, EPOR, BPGM, VHL, EGLN1, EPAS1, ASXL1, HFE, HFE2, HAMP, FTL, FTH, SLC40A1, SLC11A2 and TFR2. The study was carried out in 118 sporadic IE patients (M/F =101/17; mean age 53.7±17.2 years), regularly followed in our surgery. The approach used for library preparation was multiplexing PCR and data were analysed using bioinformatics tools to obtain the germline and somatic variants of our patients. Germline variants were observed in 78 (66,10%) patients around 118 IE patients. Among these 78 patients, with at least one variant, 23 patients (29.50%) had multiple genes variants. Germline variants were observed in HFE, EGLN1, EPAS1, EPO-R, JAK2 and TFR2 genes. We also found 3 patients with a somatic variant: two patients have a stop-gain variant in the ASXL1 gene and one has a deletion in SLC40A1 gene. During our study, one of the somatic variants identified in the ASXL1 gene was found in a young boy who also presented two other germline alterations: EGLN1C127S and JAK2L393V. Considering this and following the identification of genetic alterations linked to erythrocytosis also in the father of the proband, we decided to study 14 other subjects of the Venetian family with our NGS panel. In this family, we identified 9 carriers of the EGLN1Cys127Ser, 4 carries of the HIF-2αT766P and 1 of the EPOR variant. Two cases carried both the Tibetan and HIF-2α mutation. In 1 patient a heterozygous HFE mutation was observed and in 3 patients the rare germline JAK2L393V variant was found. NGS gene panels are a good investigation technique opening new perspectives in the knowledge of idiopathic erythrocytosis and in erythrocytosis with a family history. HFE is the most common altered gene and, with variants in the TFR2 gene, supporting the hypothesis of the existence of a relationship between genes involved in iron metabolism and erythropoiesis. Some patients underline a possible multigenic nature of erythrocytosis because more than one altered gene has been found. This data is also supported by the Venetian family studied by us in which a complex picture of hereditary erythrocytosis was found in which several known genes in erythrocytosis were present in the same family. In conclusion, this study demonstrated the importance and power of the NGS method in the investigation of patients with idiopathic erythrocytosis, however, the need to investigate the biomolecular aspects that characterise each single variant, not yet described, is important for understanding the onset and severity of IE.

L'eritrocitosi assoluta è una condizione clinica in cui i pazienti sono caratterizzati da un aumento della produzione di globuli rossi che di norma si manifesta con livelli di emoglobina superiori a 165 g/L o 160 g/L o ematocrito superiore a 49% o al 48%, rispettivamente nei maschi e nelle femmine. La policitemia vera (PV), un'eritrocitosi primaria acquisita, è causata dalla mutazione V617F o da mutazioni nell'esone 12 del gene JAK2. Tra le forme acquisite vi sono anche le eritrocitosi secondarie che si manifestano per produzione appropriata o inappropriata di eritropoietina (EPO). Le eritrocitosi congenite sono classificate come primaria quando il paziente è portatore di mutazioni nel gene del recettore dell'eritropoietina (EPOR) e in secondaria quando il paziente presenta difetti nei geni coinvolti nella via di rilevamento dell'ossigeno (VHL, PHD2, HIF-2α) o che causano ipossia tissutale come mutazioni dei geni dell’emoglobina (HBB o HBA) o difetti della bifosfoglicerato mutasi (BPGM). Nel 70% dei pazienti, la causa della loro eritrocitosi assoluta non viene identificata e viene fatta una diagnosi di Eritrocitosi Idiopatica (EI). Recentemente, in alcuni pazienti con EI sono state riscontrate mutazioni nel gene HFE suggerendo il possibile coinvolgimento del metabolismo del ferro. Abbiamo creato un pannello ad hoc di Next Generation Sequencing (NGS) per l'identificazione delle varianti in quindici geni: JAK2, EPOR, BPGM, VHL, EGLN1, EPAS1, ASXL1, HFE, HFE2, HAMP, FTL, FTH, SLC40A1, SLC11A2 e TFR2. Lo studio è stato condotto su 118 pazienti con EI sporadica (M/F =101/17; età media 53,7±17,2 anni), regolarmente seguiti nel nostro ambulatorio. L'approccio utilizzato per la preparazione della libreria è stato un multiplexing PCR e i dati sono stati analizzati mediante tool bioinformatici ottenendo le varianti germinali e somatiche dei nostri pazienti. Le varianti germinali sono state identificate in 78 (66,10%) pazienti sui 118 pazienti con EI. Tra questi 78 pazienti con almeno una variante, 23 (29,50%) presentavano più varianti geniche. Sono state osservate varianti geminali in HFE, EGLN1, EPAS1, EPOR, JAK2 e TFR2. Abbiamo anche trovato 3 pazienti con una variante somatica: due pazienti hanno una variante stop-gain in ASXL1 e uno ha una delezione in SLC40A1. Durante il nostro studio, una delle varianti somatiche identificate nel gene ASXL1 è stata trovata in un giovane ragazzo che presentava anche altre due alterazioni germinali: EGLN1C127S e JAK2L393V. Considerando queste informazioni e in seguito all'identificazione di alterazioni genetiche legate all'eritrocitosi anche nel padre del probando, abbiamo deciso di studiare altri 14 soggetti della famiglia veneziana. In questa famiglia abbiamo identificato 9 portatori di EGLN1C127S, 4 portatori di HIF-2αT766P e 1 della variante EPOR. Due casi portavano sia la mutazione tibetana che quella HIF-2α. In 1 paziente è stata osservata una mutazione in eterozigosi in HFE e in 3 pazienti è stata trovata la rara variante germinale JAK2L393V.I pannelli genici NGS sono una buona tecnica di indagine che apre nuove prospettive nella conoscenza dell’EI e dell'eritrocitosi con una storia familiare. HFE è il gene maggiormente alterato e assieme alle varianti di TFR2 viene supportata l'ipotesi dell'esistenza di una relazione tra i geni coinvolti nel metabolismo del ferro e l'eritropoiesi. Alcuni pazienti sottolineano una possibile natura multigenica dell'eritrocitosi. Questo dato è sostenuto anche dalla famiglia veneziana, in cui è stato trovato un quadro complesso di eritrocitosi ereditaria dove diversi geni noti nell'eritrocitosi erano alterati nella stessa famiglia. In conclusione, questo studio ha dimostrato l'importanza e la potenza della metodica NGS nell'indagine di pazienti con EI, tuttavia, la necessità di indagare gli aspetti biomolecolari che caratterizzano ogni singola variante, non ancora descritta, è importante per comprendere le EI.