Dynamic Nanoproteins: Self-Assembly of Peptides on Monolayer Protected Gold Nanoparticles

Le interazioni proteina-proteina controllano un gran numero di vie regolatorie all'interno dell'organismo e giocano un ruolo chiave in molte patologie. Il riconoscimento della superficie di una proteina permette di ottenere un potente strumento per la regolazione di queste interazioni. Le nanoparticelle d'oro sono un’adeguata piattaforma per la multi-funzionalizzazione con un'ampia gamma di leganti biologici per l'interazione selettiva e la rivelazione di target biologici come proteine. In particolare le nanoparticelle d'oro funzionalizzate con frammenti peptidici sono molto interessanti per questo scopo, dal momento in cui i peptidi contengono tutte le informazioni chimiche necessarie per interagire con le proteine presenti in natura. In passato l'auto assemblaggio, la spontanea organizzazione di molecole in aggregati ordinati, è emersa come una via molto promettente per lo sviluppo di sistemi altamente complessi di dimensione nanometrica. AuNPs funzionalizzate con tioli che presentano 1,4,7 triazaciclononano (TACN)Zn(II) come gruppi di testa possono essere utilizzate come validi sistemi per la formazione di strutture supramolecolari multivalenti. In questo PhD l'auto-assemblaggio di piccoli peptidi su nanoparticelle d’oro protette da un monostrato costituito da tioli è stato studiato come mezzo per sviluppare nanoproteine dinamiche per applicazioni come il riconoscimento biomolecolare e la catalisi. La prima parte è stata dedicata all’identificazione e ottimizzazione di piccoli peptidi capaci di legarsi con alta affinità alla superficie delle Au NP 1, che sono nanoparticelle d’oro (d ~ 2 nm) ricoperte da un monostrato di tioli costituiti da una catena alchilica con nove carboni e 1,4,7-triazaciclononano • Zn(II) come gruppo di testa. I risultati hanno mostrato quattro potenziali candidati di cui il tripeptide LWS (p) (S (p) = fosfoserina) presenta la più alta affinità. Da una serie di studi in cui è stato variato il metallo-ione coordinato al 1,4,7-triazaciclononano nel monostrato, lo Zn(II) ha dato i migliori risultati. Utilizzando LWS (p) come struttura principale, una piccola libreria di peptidi è stata sintetizzata in cui ulteriori residui amminoacidici sono stati attaccati all'unità vincolante. Gli amminoacidi contenenti cariche negative o positive, catene laterali polari o apolari sono stati scelti in modo di creare una libreria chimica con ampia diversità. Successivi studi di interazione hanno mostrato che tutti i peptidi avevano un'affinità molto elevata per le Au NP 1, tranne i peptidi contenenti amminoacidi carichi positivamente. Successivamente, aggiungendo tutti i peptidi contemporaneamente sulle Au NP 1, si è cercato di promuovere l’autoassemblaggio di una nano-proteina dinamica. Studi di affinità hanno rivelato che l’interazione avviene in condizioni di saturazione a concentrazioni in scala micromolare (tampone acquoso, pH = 7). L'aggiunta di un composto che compete con i peptidi per la superficie delle Au NP 1 provoca uno spiazzamento completo dei peptidi mostrando la natura dinamica della superficie. In questo modo è stato dimostrato che è possibile costruire in modo semplice un sistema multivalente complesso. La natura dinamica del sistema è stata sfruttata in una serie di esperimenti di auto-selezione, volti a determinare come la composizione della superficie peptidica sulle Au NP 1 cambi dopo l’aggiunta di un eccesso di peptidi. È stato sviluppato un nuovo protocollo basato sull'impiego di filtri da ultracentrifugazione contenenti una membrana con un determinato limite di PM allo scopo di analizzare la composizione dei peptidi sulla superficie. I risultati hanno mostrato una spontanea selezione dei peptidi con una maggiore affinità per Au NP 1 all'aumentare della concentrazione complessiva della libreria peptidica. Nella fase successiva, è stata studiata la capacità delle nano-proteine di interagire con superfici proteiche naturali. La chimotripsina serina proteasi (ChT) è stata scelta come target. Era già riportato in letteratura, infatti, che le Au NP funzionalizzate con peptidi sono in grado di interagire con la ChT. Esperimenti di binding hanno confermato che la presenza della proteina non influenza l'interazione tra la libreria peptidica e le Au NP 1. Nessuno dei peptidi è stato idrolizzato dalla ChT, a parte il peptide P2. Gli studi sull'attività enzimatica in presenza di Au NP 1-peptide non hanno fornito dati conclusivi. I dati ottenuti hanno mostrato una lieve attivazione della ChT (1.5 volte) in presenza di Au NP, indipendentemente dalla presenza dei peptidi. Una tale attivazione della ChT dovuta agenti cationici è stata riportata anche in altri studi, ma una spiegazione chiara non è ancora disponibile. L'attenzione, quindi, si è spostata verso un metodo diretto per misurare l'interazione tra i nano-proteine e ChT basandosi sugli esperimenti di ultracentrifugazione sviluppati in precedenza, considerando che la misurazione dell'attività enzimatica è un metodo indiretto. L'obiettivo era quello di verificare se la composizione della superficie risentisse dell'aggiunta della proteina. I dati iniziali degli esperimenti di ultracentrifugazione e studi di fluorescenza supplementari sembravano suggerire la formazione di un complesso ternario multivalente tra le Au NP 1 e la ChT e il peptide P1. Tuttavia, ulteriori esperimenti con diverse condizioni sperimentali e l’utilizzo di altre tecniche di analisi (come la ITC e DLS) sono necessari per confermare questi risultati. Infine, una collaborazione con il Prof. Ulijn presso l'Università di Strathclyde ha portato ad un esame approfondito dell’attività fosfatasi delle Au NP 1. L'idea originale era quella di sfruttare l'alta affinità dei peptidi per Au NP 1 per spostare l'equilibrio di un sistema dinamico di inter-conversione degli stessi (catalizzata dalla termolisina). Tuttavia, gli studi iniziali hanno rivelato che, dopo alcuni giorni, la miscela composta da nanoparticelle ed enzima ha causato la defosforilazione dell’ Fmoc-Yp-OH. Questa osservazione ha portato ad uno studio più approfondito sull'origine di questa reazione. I primi esperimenti effettuati ad alte concentrazioni hanno indicato che la termolisina assistita dallo Zn(II) o dalle Au NP 1 è la prima responsabile della reazione di defosforilazione. In queste condizioni non è stata osservata nessuna attività da parte delle Au NP 1. Il quadro è cambiato completamente nel momento in cui gli studi cinetici sono stati ripetuti a più basse concentrazioni (micromolare). È stato rilevata una forte attività catalitica dalle Au NP 1. In condizioni in cui la concentrazione dell’Fmoc-Yp-OH è vicina alla SSC sulle Au NP 1, sono state necessarie soltanto 10 ore per convertire il 50% del substrato. Tuttavia, per una precisa comprensione del meccanismo sono necessari ulteriori studi, il fatto che le Au NP 1 siano in grado di provocare la defosforilazione di un monofosfato è un risultato molto interessante, considerando che l'attività catalitica delle Au NP 1 e sistemi relativi sono limitati, finora, principalmente a fosfodiesteri attivati.