Protein kinase CK2: a new target to overcome imatinib-resistance in chronic myeloid leukemia cells

La leucemia mieloide cronica (LMC), una malattia mieloproliferativa maligna del sistema ematopoietico, è determinata dalla traslocazione cromosomica [t(9; 22)(q34, q11)], che causa la formazione del cromosoma Philadelphia e del gene di fusione BCR-ABL1. Tale gene codifica per la proteina Bcr-Abl, una tirosin chinasi costitutivamente attiva, necessaria e sufficiente per l’insorgere, il mantenimento e la progressione della patologia [Faderl S. et al., 1999]. Nonostante la grande efficacia dell’imatinib, inibitore specifico di Bcr-Abl, che rappresenta il farmaco d’elezione per il trattamento dei pazienti affetti da LMC, la resistenza a questo farmaco è riconosciuta come uno dei maggiori problemi del fallimento chemioterapico [Bixby D. and Talpaz M., 2009]. In questo contesto, il lavoro della mia tesi è stato rivolto allo studio della protein chinasi CK2, una serin/treonin chinasi ubiquitaria, pleiotropica e costitutivamente attiva, composta da due subunità catalitiche (alfa e/o alfa prima) e due regolatorie (beta). Il livello proteico di CK2 è anormalmente elevato in un ampio numero di tumori, in cui tuttavia la chinasi non è mai riconosciuta come la causa che scatena la patologia ma risulta essere criticamente necessaria per l’instaurarsi di un ambiente cellulare favorevole allo sviluppo della neoplasia, principalmente grazie al suo ruolo anti-apoptotico e pro-sopravvivenza [Ruzzene M. and Pinna L.A., 2010]. L’obiettivo della ricerca è quello di far luce sul ruolo svolto dalla protein chinasi CK2 nelle vie oncogeniche di segnale che caratterizzano la LMC, utilizzando le due linee cellulari LAMA84 e KCL22, sia sensibili (S) che resistenti (R) all’imatinib. Nel mio laboratorio era stato precedentemente osservato che le cellule LAMA84 resistenti all’imatinib, caratterizzate dell’amplificazione del gene BCR-ABL1 [Le Coutre P. et al., 2000], contengono una quantità proteica delle subunità CK2 alfa e CK2 beta, ma non CK2 alfa prima, circa due volte superiore rispetto alle cellule sensibili all’imatinib [Borgo C. et al., 2013]. In accordo con questo risultato, la quantificazione proteica delle subunità di CK2 dimostra che il livello della chinasi è marcatamente elevato nelle cellule LAMA84 rispetto alle proteine totali. L’analisi del frazionamento subcellulare mostra che la maggior parte di CK2 si trova nella frazione citoplasmatica delle cellule R-LAMA84, dove co-localizza con Bcr-Abl. CK2 e Bcr-Abl sono membri dello stesso complesso multi-proteico ed interagiscono tra loro solo nelle cellule LAMA84 resistenti all’imatinib, come dimostrato dagli esperimenti di co-sedimentazione in gradienti di glicerolo e di co-immunoprecipitazione. È interessante notare che, mentre il trattamento cellulare con imatinib non influenza l’interazione tra CK2 e Bcr-Abl, il CX-4945, uno specifico inibitore di CK2, abolisce quasi interamente questo legame, suggerendo che l’attività chinasica di CK2 svolga un ruolo specifico nel legame tra le due proteine. Diversamente da quanto descritto nelle cellule LAMA84, le cellule KCL22 resistenti all’imatinib esprimono un livello proteico, ed un’attività chinasica, sia di CK2 che di Bcr-Abl, simile in cellule sensibili e resistenti all’imatinib. CK2 risulta inoltre interagire con Bcr-Abl in entrambe le varianti cellulari di KCL22. Per valutare se CK2 potesse avere un ruolo nella resistenza all’imatinib anche nelle cellule KCL22, abbiamo studiato la complessa rete oncogenica regolata da Bcr-Abl, dedicando particolare attenzione alle seguenti due vie di trasduzione del segnale: MAPK e PI3K/Akt/mTOR, spesso iperattivate nelle cellule tumorali [Saini K.S. et al., 2013]. E’ stato trovato che, rispetto alle cellule sensibili, le cellule KCL22 resistenti all’imatinib sono caratterizzate da un più elevato grado di fosforilazione delle seguenti proteine nei loro siti regolatori: ERK1/2 (T202/Y204), come precedentemente riportato da Colavita I. et al. (2010), Akt (S473) e rpS6 (S240/4-235/6). Nelle cellule R-KCL22, il trattamento con alte concentrazioni di imatinib riesce ad inibire drasticamente la fosforilazione di ERK1/2 (T202/Y204) e Akt S473, mentre, inaspettatamente, diminuisce solo in parte la fosforilazione di rpS6, l’effettore comune a valle delle vie di segnale MAPK e PI3K/Akt/mTOR. È interessante notare che la fosforilazione di rpS6 è invece praticamente abolita dall’inibizione dell’attività catalitica di CK2. Tale risultato è dimostrato sia dal trattamento cellulare con CX-4945, il quale non altera nè il grado di fosforilazione di ERK1/2 né quello di Akt S473, che dal silenziamento genico tramite interferenza dell’mRNA di CK2. In parallelo al diminuito grado di fosforilazione di rpS6, proteina coinvolta nella fase dell’inizio della traduzione, il trattamento delle cellule R-KCL22 con CX-4945 riduce l’efficacia della sintesi proteica cellulare di circa il 50% rispetto al controllo. Per valutare ulteriormente il contributo di CK2 nella leucemia mieloide cronica, è stato esaminato l’effetto dell’inibizione dell’attività chinasica di CK2 sulla vitalità cellulare. Il trattamento cellulare con CX-4945 riduce in modo significativo la vitalità delle cellule e induce apoptosi in entrambe le linee cellulari LAMA84 e KCL22, sia nella variante sensibile che in quella resistente all’imatinib. Tuttavia, le concentrazioni di CX-4945 necessarie per indurre apoptosi nelle cellule resistenti sono inferiori rispetto a quelle efficaci nelle cellule sensibili, suggerendo come le cellule resistenti siano maggiormente dipendenti da CK2 per la loro sopravvivenza. È inoltre interessante notare che, il trattamento combinato di CX-4945 con imatinib promuove un effetto sinergico sulla riduzione della vitalità delle cellule resistenti all’imatinib in entrambe le linee cellulari di LMC, ripristinando parzialmente l’effetto dell’imatinib. Nelle cellule R-KCL22, è stato anche dimostrato che l’inibizione di CK2 rende le cellule leucemiche sensibili all’azione di altri composti come l’U0126, un inibitore della via di segnale MAPK, e la rapamicina, inibitore specifico del complesso mTORC1. L’associazione ternaria di CX-4945, imatinib e U0126 rappresenta la migliore associazione sinergica capace di ridurre la vitalità delle cellule R-KCL22. Nel loro insieme, i nostri risultati mettono in luce come CK2 svolga un ruolo da protagonista nelle cellule LMC resistenti all’imatinib e suggeriscono come la chinasi possa rappresentare un promettente bersaglio per lo studio di strategie farmacologiche combinate per il trattamento della LMC nei pazienti resistenti all’imatinib.