Production and characterization of therapeutic proteins/peptides: Human Recombinant FSH-beta subunit expressed in Plant Cells and Chemical Synthesis of Human Osteocalcin and Neuritogenic Peptides

Dagli anni 80, le proteine terapeutiche sono emerse come la classe di farmaci più promettenti con più di 350 prodotti in commercio tra terapeutici, diagnostici e vaccini. Nel 2015 tra i 10 farmaci più venduti al mondo, 7 sono proteine ricombinanti od anticorpi monoclonali. C’è ancora confusione relativamente al concetto di proteina terapeutica. Le autorità regolatorie come FDA ed EMA hanno dato diverse definizioni sulla base dei sistemi di produzione, delle fonti biologiche e della categoria farmaceutica di appartenenza. L’Agenzia Europea dei Medicinali (EMA) descrive i prodotti medicinali biologici come sostanze farmaceutiche di natura proteica (o acidi nucleici) utilizzate in vivo per scopi terapeutici o diagnostici, le quali sono prodotte con metodologie diverse dalla diretta estrazione da fonti biologiche native (non ingegnerizzate geneticamente). Questa definizione suggerisce che anche le piccole proteine e peptidi prodotti chimicamente siano considerate proteine terapeutiche. Oggigiorno, la maggior parte delle proteine approvate per scopi terapeutici sono prodotte con la tecnologia del DNA ricombinante. Le cellule ovariche di criceto cinese (CHO) sono considerate i bioreattori per eccellenza poiché sono in grado di apportare le modifiche post-traduzionali adatte e necessarie per una corretta attività biologica. Recentemente le piante sono emerse come un’attraente alternativa ai normali sistemi di espressione grazie ai vantaggi di tipo economico, di sicurezza, del corretto folding della proteina e del pattern di glicosilazione simile a quello umano. Nel 2013 l’autorità regolatoria americana ha approvato il primo farmaco proteico prodotto interamente in pianta contro la malattia di Gaucher. In questo scenario, Active Botanicals Research (Brendola, VI, Italia), ha proposto linee cellulari in sospensione da N. benthamiana come piattaforma alternativa per l’espressione di proteine ricombinanti ed in particolare per la sub unità beta dell’ ormone follicolo stimolante (FSH). L’ormone follicolo stimolante è una gonadotropina che stimola la produzione di steroidi e dei gameti nelle gonadi per supportare e regolare la maturazione follicolare nelle donne e degli spermatozoi nei maschi. FSH è utilizzato clinicamente per controllare la stimolazione ovarica nella fecondazione assistita, nei casi d’infertilità femminile e ipogonadismo maschile. FSH è somministrato in due forme: la proteina ricombinante espressa in CHO (Gonal-F® (Merck Serono) and Puregon® (Merck Sharp and Dohme)) o purificata dall’urina di donne in menopausa (Menopur® (Ferring) and Merional® (Pharmasure)). Il primo capitolo di questa tesi affronta il processo di estrazione, purificazione e caratterizzazione della sub unità beta dell’ormone follicolo stimolante espresso in cellule in sospensione di N. benthamiana. L’estrazione sfrutta il KDEL: un segnale di ritenzione che è aggiunto all’estremità C-terminale della proteina e che permette di bloccarla all’interno del reticolo endoplasmatico. Il prodotto purificato è stato ottenuto in seguito a tre step cromatografici consecutivi: cromatografia di affinità (IMAC), ad esclusione molecolare e in fine a scambio ionico. Due isoforme della stessa proteina ricombinante sono state caratterizzate chimicamente mediante deglicosilazione enzimatica con PNGase F e digestione triptica in modo da coprire totalmente la sequenza aminoacidica e in secondo luogo assegnare tutti e sei i ponti disolfuro dimostrando il corretto folding della proteina. E’ risaputo che l’ormone follicolo stimolante svolge la sua funzione come etero dimero. In tutte le glicoproteine, la comune subunità alpha è legata in modo non covalente alla subunità beta, la quale è unica nella sequenza e struttura per ciascun membro della famiglia. Tuttavia, alcuni studi suggeriscono una possibile attività biologica da parte della singola subunità beta paragonabile all’intero etero dimero. In commercio è presente una preparazione con dichiarata attività biologica (FSHβ subunit ab191730 Abcam). La specie purificata da ABResearch è stata testata su cellule isolate del Sertoli da testicolo di maiale. I dati preliminari hanno dimostrato l’assenza di attività biologica del singolo monomero. Aspettando la produzione della subunità alpha, l’etero dimero tra la subunità beta di ABR e la subunità alpha commerciale è stato costituito e testato dimostrando un’attività paragonabile al prodotto commerciale. I dati sperimentali sostengono quindi le potenzialità di questo nuovo sistema di espressione di proteine terapeutiche, ottenendo inoltre delle rese che superano notevolmente le rese medie ottenute dai classici sistemi vegetali (4.5/5 mg per Kg di cellule). Nel secondo capitolo di questo lavoro è descritta la sintesi chimica di osteocalcina umana 1-49 (OC) mediante la sintesi di peptidi su fase solida con strategia Fmoc. Osteocalcina umana è una piccola proteina di 49 amino acidi prodotta principalmente dagli osteoblasti e rappresenta una delle proteine più abbondanti nel tessuto osseo dei vertebrati con un altissimo grado di conservazione della struttura primaria. E’ risaputo che osteocalcina acquisisce la sua caratteristica affinità per gli ioni calcio in seguito a specifiche modifiche post traduzionali da parte dell’enzima vitamina K dipendente glutamil-carbossilasi a livello di specifici residui di acido glutammico. Il binding con gli ioni calcio stabilizza la struttura alpha elica della proteina. OC è coinvolta in diversi campi diagnostici a causa del suo ruolo cruciale in diversi processi fisiologici che comprendono il rimodellamento osseo, produzione e regolazione di insulina, secrezione di testosterone a livello testicolare e regolazione di neuro trasmettitori. Recentemente è stata proposta come proteina capace di regolare l’attività androgena in modo non steroideo. Oggigiorno OC è ottenuta mediante estrazione da ossa di defunti o mediante sintesi chimica su fase solida con strategia di Boc. In seguito alla scarsa disponibilità di tessuto osseo e agli ovvi problemi etici, la sintesi chimica rappresenta la principale via di approvvigionamento. In questa tesi si propone una strategia alternativa (Fmoc chemistry) conosciuta per le maggiori rese di reazione, vantaggi economici, maggiore sicurezza e minore contributo di reazioni collaterali rispetto alla classica strategia di Boc. La sintesi chimica è stata ottimizzata fino a ottenere una resa del 80/85% superando largamente le rese medie della classica sintesi chimica. La proteina purificata è stata soggetta al processo ossidativo per la costituzione del ponte disolfuro ed ottenere così la proteina nella forma nativa. In seguito alla caratterizzazione chimica mediante RP-HPLC e spettrometria di massa, OC è stata caratterizzata da un punto di vista conformazionale mediante tecniche spettroscopiche come dicroismo circolare nel lontano UV e fluorescenza. Studi di binding al calcio sono stati condotti mediante l’utilizzo di tecniche spettroscopiche paragonando OC sintetizzata con quella commerciale (Bachem). Il terzo capitolo riguarda i peptidi come prodotti terapeutici. I peptidi ricoprono ruoli fisiologici cruciali come fattori di crescita, ormoni, ligandi di canali ionici, neurotrasmettitori e sono riconosciuti per la loro alta selettività ed efficacia come segnali molecolari con un attraente profilo farmacologico. I peptidi rappresentano una nuova attraente prospettiva nel settore farmaceutico grazie al loro grado di sicurezza, tollerabilità ed efficacia. La minor complessità di produzione e prezzi notevolmente più contenuti ha attirato l’interesse della ricerca scientifica sui peptidi come potenziali farmaci rispetto alle proteine terapeutiche. Oggigiorno i peptidi sintetizzati vengono utilizzati nella medicina rigenerativa grazie al loro potenziale nella trasmissione del segnale, elongazione di neuriti e differenziazione cellulare. Dieci nuovi peptidi derivanti da molecole di adesione cellulare e proteine della matrice cellulare (CHL1, Neurofascin, NrCAM, DCC, ROBO2 and 3, LINGO2, Contactin 1, 2 and 5) sono stati progettati per mimare i segnali guida nell’ambiente neurale. I peptidi sono stati sintetizzati su fase solida e purificati mediante RP-HPLC, analizzati mediante spettrometria di massa e dicroismo circolare. In accordo con i dati ottenuti con i peptidi L1-A e LINGO1-A, tutti e dieci i peptidi testati su linee cellulari di neuroblastoma umano hanno dimostrato di essere efficaci nella differenziazione neuronale ed in particolare nella crescita ed elongazione dei neuriti. Questi dati preliminari suggeriscono un prototipo per lo sviluppo di impianti per la crescita e differenziazione neuronale a lungo termine.