Innovative strategies for tailoring therapy in cancer patient: pharmacogenetics and hormone therapy personalization in metastatic or locally advanced breast cancer patients treated with Exemestane

Introduzione: La risposta agli agenti chemioterapici è altamente variabile tra i pazienti sia per quanto riguarda l’efficacia che la tollerabilità, di conseguenza la personalizzazione della terapia è uno dei principali obiettivi della ricerca in campo oncologico con l’obiettivo di ridurre le reazioni avverse al farmaco, migliorarne l’efficacia e nel contempo contenerne i costi. I fattori responsabili della variabilità interindividuale sono molteplici. Tra questi, il background genetico dei pazienti ha attratto interesse per la personalizzazione della terapia (Farmacogenetica). Il carcinoma mammario (breast cancer - BC) rappresenta la neoplasia più frequentemente diagnosticata e la prima causa di morte collegata al cancro tra le donne. Nel 2008 sono stati registrati, a livello mondiale, 1.380.000 nuovi casi e 458.000 morti a causa del cancro della mammella. Il recettore degli estrogeni (estrogen receptor - ER) risulta iper-espresso in circa l’80% dei casi di BC e le cellule cancerose positive al ER (ER+) dipendono dagli estrogeni per la loro crescita. Nelle donne in menopausa, gli estrogeni derivano unicamente dagli androgeni attraverso una reazione di aromatizzazione. L’aromatasi (CYP19A1) è un enzima chiave in questo processo e, per questa ragione, è diventato il target di numerosi farmaci inibitori, compreso exemestane. Il trattamento anti-aromatasi rappresenta attualmente il cardine della terapia del ER+ BC nelle donne in menopausa. Exemestane è un inibitore irreversibile dell’aromatasi (AI) di terza generazione e di tipo steroideo che determina l’inattivazione dell’enzima, provocando quindi l’inibizione della sintesi estrogenica. Exemestane è un farmaco impiegato in assetto adiuvante per il ER+ BC invasivo allo stadio precoce ed in assetto avanzato se la malattia è progredita dopo una precedente terapia anti-estrogenica. Sono state descritte numerose variazioni genetiche germinali (polimorfismi) in geni coinvolti sia nell’attività e metabolismo degli estrogeni che nella farmacocinetica di exemestane. Obiettivi: questa tesi di dottorato ha avuto un duplice obiettivo: * mettere a punto un metodo di indagine farmacogenetica per analizzare polimorfismi correlati ad estrogeni ed exemestane (polimorfismi a singolo nucleotide – SNPs e microsatelliti (short tandem repeats) - STRs) * determinare il ruolo predittivo e prognostico di tali polimorfismi come biomarcatori di efficacia del trattamento a base di exemestane, in termini di Response Rate (RR), Clinical Benefit (CB), tempo alla progressione (TTP) e sopravvivenza globale (OS). Sono stati considerati quindici polimorfismi in geni coinvolti nella sintesi (CYP17A1 e CYP19A1), attività (ESR1, ESR2 e RIZ1) e metabolismo (CYP1B1, UGT1A1 e COMT) degli estrogeni insieme a geni implicati nel pathway metabolico di exemestane (CYP3A4 e CYP3A5). Come obiettivo primario dello studio clinico è stato considerato lo SNP CYP19A1_Ex11_410A/C (rs4646) della regione non 3’ tradotta (3’ untraslated region - 3’UTR) del gene dell’aromatasi, già in precedenza associato ad una migliore sopravvivenza libera da malattia (disease free servival – DFS) (Colomer et al., 2008) in pazienti trattate con l’AI letrozolo e con la miglior OS in pazienti trattate con un altro AI, l’anastrozolo (Liu et al., 2013). Ciononostante, il ruolo di questo polimorfismo non è stato ancora chiaramente definito. Sono stati analizzati anche altri polimorfismi del gene CYP19A1 (CYP19A1_47T/C (rs700519), CYP19A1_1558T/C (rs10046) e CYP19A1_(TTTA)n (rs60271534)) insieme ad uno SNP nel gene CYP17A1(CYP17A1_27A/G (rs743572)), codificante per un altro enzima responsabile della sintesi degli estrogeni. Inoltre, sono stati indagati polimorfismi dei geni codificanti per: * i recettori degli estrogeni: ESR1: ESR1_497T/C (rs2234693), e ESR1_256A/G (rs9340799); ESR2: ESR2_1082A/G (rs1256049), e ESR2_1730A/G (rs4986938); RIZ1: RIZ1_delP704 (rs2308040); * gli enzimi deputati al metabolismo degli estrogeni: CYP1B1: CYP1B1*3_4326G/C (rs1056836), UGT1A1: UGT1A1*28_ TA(6/7) (rs8175347) e COMT: COMT_12A/G (rs4680); * gli enzimi responsabili del metabolismo ossidativo di exemestane: CYP3A4: CYP3A4*1B_-392A/G (rs2740574) e CYP3A5: CYP3A5*3_6986A/G (rs776746). Metodi: le analisi genetiche sono state condotte in un gruppo di 275 pazienti affetti da ER+ BC metastatico o localmente avanzato trattate con exemestane come prima linea di trattamento ormonale. Ai pazienti è stato effettuato un prelievo ematico prima dell’inizio della terapia. Il DNA è stato poi estratto dal campione di sangue intero ed amplificato tramite la reazione a catena della polimerasi (PCR). Per le analisi genetiche sono state messe a punto quattro tecniche di genotipizzazione: Pyrosequencing, Saggio di Discriminazione Allelica mediante sonde TaqMan®, Analisi dei Frammenti Automatizzata ed il saggio GoldenGate di Illumina. Sono state valutate le associazioni statistiche tra i determinanti genetici e l’outcome clinico dei pazienti attraverso il Test Esatto di Fisher a due vie per l’associazione di polimorfismi e risposta clinica e attraverso lo stimatore del prodotto limite di Kaplan Meier e il test dei ranghi logaritmici per l’associazione tra polimorfismi e TTP/OS. Risultati: per ogni polimorfismo è stata scelta la tecnica di indagine molecolare più appropriata a seconda del miglior risultato ottenuto durante la fase di messa a punto delle metodologie. Di conseguenza: * tre SNPs sono stati analizzati con il Pyrosequencing: CYP19A1_47T/C (rs700519), CYP3A4*1B_-392A/G (rs2740574), e RIZ1_delP704 (rs2308040); * dieci SNPs sono stati genotipizzati con il saggio di Discriminazione Allelica mediante sonde TaqMan®: CYP19A1_Ex11+410A/C (rs4646), CYP19A1_1558T/C (rs10046), CYP3A5*3_6986A/G (rs776746), COMT_12A/G (rs4680), ESR1_497T/C (rs2234693), ESR1_256A/G (rs9340799), ESR2_1082A/G (rs1256049), ESR2_1730A/G (rs4986938), CYP17A1_27A/G (rs743572) e CYP1B1*3_4326G/C (rs1056836); * due STR sono stati esaminati attraverso l’Analisi dei Frammenti Automatizzata: CYP19A1_(TTTA)n (rs60271534) e UGT1A1*28_ TA(6/7) (rs8175347); * i campioni analizzati per dodici dei sopraccitati polimorfismi sono stati, inoltre, inclusi nel saggio Illumina GoldenGate come controlli positivi. Il risultato di questo processo di validazione è stata una concordanza del 100% tra i genotipi ottenuti con questa tecnica e quelli derivanti dalle precedenti indagini. Tra i polimorfismi analizzati, è stata osservata un’associazione statisticamente significativa per CYP1B1, gene codificante per l’enzima responsabile del metabolismo ossidativo di prima fase degli estrogeni. L’allele variante G del polimorfismo CYP1B1*3_4326G/C (rs1056836) è stato significativamente associato con la risposta clinica ad exemestane (RR, ORGG = 2.91, 95% CI = 5.88 – 1.25, p = 0.0039; secondo il Test Esatto di Fisher a due vie). Lo stesso allele variante è stato significativamente associato anche al TTP e alla OS (TTP, modello dominante: HR CG+GG= 0.66, 95% CI = 0.50 – 0.87, p = 0.0037; OS, modello dominante = HR CG+GG= 0.66, 95% CI = 0.46 – 0.95, p = 0.023, secondo il test dei ranghi logaritmici). Questo significa che pazienti portatori di almeno un allele G non solo hanno dimostrato una miglior risposta clinica al trattamento ma hanno anche avuto una progressione più tardiva ed una sopravvivenza più lunga dei pazienti wild type. Per quanto riguarda il gene dell’aromatasi, l’unica associazione riscontrata, anche se marginale, riguarda il polimorfismo CYP19A1_1558T/C (rs10046) il cui allele variante C che è stato associato ad un ridotto TTP (HRCC modello recessivo =1.4, 95%CI = 1.04 – 1.89, p = 0.028, secondo il Test Esatto di Fischer a due vie). Al contrario, non è stata riscontrata alcuna associazione significativa tra lo SNP CYP19A1_Ex11_410A/C (rs4646), obiettivo principale dello studio, e RR, CB, TTP o OS. Riguardo i polimorfismi del gene dell’aromatasi, siamo stati in grado di descrivere una nuova variante genetica per il polimorfismo STR CYP19A1_(TTTA)n (rs60271534) dell’introne 4. Le banche dati genetiche e la letteratura riportano che il numero di ripetizioni della quadripletta TTTA vari tra 7 e 13, ma nel nostro studio è stato individuato un allele, finora mai descritto, con 14 ripetizioni. Conclusioni: in conclusione, questo lavoro di tesi ha permesso di definire un nuovo biomarcatore molecolare, lo SNP CYP1B1*3_4326G/C (rs1056836), con un valore predittivo e prognostico per il trattamento a base di exemestane in pazienti affetti da ER+ BC, metastatico o localmente avanzato. Questo presuppone che, se validato, questo biomarcatore potrebbe potenzialmente essere impiegato nella pratica clinica oncologica quotidiana come strumento che potrebbe aiutare ad identificare i pazienti che hanno una maggiore probabilità di risposta all’exemestane tramite una semplice valutazione genetica da sangue periferico da effettuarsi prima della terapia. Inoltre, è stata descritta una nuova variante genetica del gene dell’aromatasi.