Role and regulation of the mitochondrial calcium uniporter (MCU) in cardiac adaptation to stresses

Dal momento della nascita, per tutta la durata della vita, il miocardio è costituito da un numero pressoché fisso di cardiomiociti (CM). Infatti, la crescita postnatale del cuore è di tipo ipertrofico, per cui lo sviluppo del cardiomiocita, anch’esso di tipo ipertrofico, avviene attraverso un profondo rimodellamento strutturale, funzionale e metabolico. Una volta raggiunto un completo sviluppo, il cuore adatta continuamente la sua contrattilità e struttura in base alle richieste perfusionali dell’organismo, che variano in base a fattori intrinseci ed ambientali. Stimoli acuti determinano la modulazione della contrattilità, mentre stimoli cronici, che richiedono una performance elevata nel tempo, fanno sì che i cardiomiociti rimodellino la loro struttura, crescendo ulteriormente per sostenere l’aumentato carico meccanico. In base a tipo, intensità e durata dello stimolo ipertrofico, il rimodellamento cardiaco può portare ad ipertrofia fisiologica (come nel caso del “cuore d’atleta”) o patologica (ad esempio nel sovraccarico pressorio): in quest’ultimo caso, la crescita ipertrofica risulterà nel tempo in scompenso cardiaco, insufficienza cardiaca e morte. Nonostante i fenotipi cellulare e clinico siano distinti, il comune denominatore di queste condizioni è che, nelle fasi iniziali, i processi sono di tipo adattativo e comprendono la deposizione di nuovi sarcomeri nei cardiomiociti, per garantire una contrattilità migliorata o quanto meno preservata. Queste proprietà richiedono entrambe una maggiore produzione di ATP. Non sorprende quindi il fatto che la regolazione della funzione mitocondriale sia un processo critico per la produzione di ATP, per soddisfare il fabbisogno energetico durante la crescita ipertrofica. I mitocondri sono la “centrale energetica” della cellula e la concentrazione di Ca2+ opera come un regolatore dinamico primario della produzione di ATP. Nei cardiomiociti, l’influsso di Ca2+ nella matrice mitocondriale avviene durante l’aumento di Ca2+ sistolico ed è mediato dal complesso dell’uniporto mitocondriale per il calcio (MCUC), recentemente identificato. L’uptake di Ca2+ mitocondriale è un processo fondamentale nella modulazione acuta della contrattilità durante la risposta “fight-or-flight” attivata dall’attivazione dei recettori ß-adrenergici. A prova di ciò, la delezione di MCU nel modello murino diminuisce la capacità d’esercizio7, mentre la riduzione di MCU nelle cellule del nodo senoatriale o dei ventricoli riduce le risposte cronotropiche o contrattili, rispettivamente, indotte dalla stimolazione ß-adrenergica. Al momento non è noto se avvengano cambi nell’espressione delle proteine formanti MCUC in diverse situazioni fisiopatologiche, così come non è noto l’effetto della modulazione dell’uptake di Ca2+ mitocondriale durante il rimodellamento cardiaco. Su queste basi, gli obiettivi del mio progetto di dottorato sono: 1) Identificare i meccanismi molecolari coinvolti nella regolazione endogena di MCU; 2) Determinare se MCU ha un ruolo nel rimodellamento fisiologico e patologico del cuore; 3) Sviluppare un modello sperimentale di cardiomiociti isolati da cuori neonati per la caratterizzazione in vitro delle dinamiche del Ca2+mitocondriale su tempi prolungati. Risultati. 1. Il contenuto dell’uniporto mitocondriale per il calcio (MCU) nei cardiomiociti è dinamicamente regolato da miR-1 nell’ipertrofia fisiologica e patologica. In esperimenti preliminari condotti nel nostro laboratorio, abbiamo confrontato i livelli proteici di MCU in cuori normali ed ipertrofici, ed abbiamo osservato che le variazioni nel contenuto proteico di MCU non erano accompagnate da variazioni in parallelo del suo trascritto. Ciò ci ha portato ad investigare se, nel rimodellamento cardiaco, potesse avvenire una regolazione post-trascrizionale di MCU. Ci siamo così focalizzati sui microRNA (miR), piccole sequenze non codificanti di RNA (18-25 nucleotidi) capaci di modulare finemente l’espressione di svariati geni, grazie all’interferenza con la stabilità o la traduzione dell’mRNA target. Un numero crescente di evidenze rivela il ruolo fondamentale dei miRs nell’ipertrofia cardiaca e, in altri tessuti, è stato dimostrato come certi miR regolino il contenuto di MCU. Tramite ricerca bioinformatica, abbiamo identificato diversi microRNA che potrebbero appaiarsi alla regione 3’UTR di MCU. Tra questi, ci siamo focalizzati su miR-1 per la sua espressione muscolo-specifica, il suo ruolo critico nell’ipertrofia cardiaca, la sua omologia conservata tra diverse specie e la specificità per MCU tra i membri del complesso MCUC. Il saggio di luciferasi ha confermato quanto predetto dalla bioinformatica ed ha permesso di identificare specifiche sequenze complementari sul gene di MCU. Consistentemente, cardiomiociti over-esprimenti miR-1 hanno mostrato un diminuito contenuto proteico di MCU senza alterazioni nel suo mRNA, risultando in una riduzione significativa nella capacità di importare Ca2+ nella matrice mitocondriale. Quindi, abbiamo testato l’ipotesi che il contenuto di MCU fosse modulato in condizioni di ipertrofia associate a variazioni nell’espressione di miR-1, quali: i) lo sviluppo postnatale, ii) l’esercizio moderato, iii) il sovraccarico pressorio. Confrontando cuori neonati ed adulti abbiamo osservato che l’espressione di miR-1 aumenta, in linea col suo ruolo di repressore del programma genico fetale. Questo calo di miR-1 è accompagnato da un aumento nel contenuto proteico di MCU senza che ne aumentasse il trascritto. Inoltre, abbiamo osservato come solo il contenuto di MCU vari, tra i vari membri del complesso, eccezion fatta per l’mRNA di MCUb, che aumenta. Quindi, abbiamo analizzato l’asse miR-1/MCU in cuori ipertrofici murini e umani, con rimodellamenti sia fisiologici che patologici. Nei topi, l’ipertrofia fisiologica è stata indotta tramite protocollo di esercizio cronico, efficace nel determinare ingrandimento cardiaco, dei singoli cardiomiociti ed un aumento della contrattilità35. Il confronto coi cuori di topi sedentari ho dimostrato come il livello di miR-1 scenda nell’esercizio e, consistentemente, quello proteico di MCU salga. L’analisi del complesso in cuori sottoposti a costrizione aortica ha dimostrato come, durante l’iniziale fase compensata, caratterizzata da crescita dei cardiomiociti senza scompenso, le variazioni di miR-1 e MCU rispecchino quelle osservate nei topi esercitati. Inoltre, le reciproche variazioni di miR-1 e MCU accadono anche in un modello di ipertrofia di rilevanza clinica, come dimostrato dalle analisi di biopsie cardiache umane provenienti da donatori sani e pazienti con ipertrofia causata da stenosi aortica. Questi risultati indicano che, indipendentemente dalla natura dello stimolo ipertrofico (fisiologico o ipertrofico), l’iniziale adattamento cardiaco all’aumentata richiesta contrattile è caratterizzato da analoghi aumenti nella disponibilità cellulare di MCU. Viste le variazioni analoghe dell’asse miR-1/MCU riscontrate sia in ipertrofia indotta da esercizio che in quella compensata patologica, abbiamo ipotizzato che ci sia un meccanismo regolatorio comune. Ci siamo così focalizzati sul sistema ß-adrenergico, il primo meccanismo fisiologico coinvolto nella risposta all’aumentato carico di lavoro, condizione che accomuna sia ipertrofia da esercizio che da costrizione aortica. L’attivazione del signalling ß-adrenergico, infatti, determina aumento delle oscillazioni di Ca2+ citosolico e conseguentemente dell’uptake mitocondriale. In parallelo, l’attivazione di queste cascate di segnale è coinvolta nell’attivazione di vie di segnale di ipertrofia come Akt-FOXO. È interessante notare che l’espressione di miR-1, come è stato dimostrato, dipende da FOXO3a, indicando che, in condizioni di attivazione cronica dei recettori ß-adrenergici, il blocco della traslocazione nucleare di FOXO3a potrebbe inibire l’aumento di miR-1. Per supportare questa ipotesi, abbiamo trattato topi sottoposti a costrizione aortica col ß-bloccante metoprololo che, in linea con quanto ipotizzato, è stato in grado di abolire la repressione di miR-1 e di conseguenza l’aumento di MCU. Conclusioni e prospettive future. Complessivamente, i nostri dati identificano miR-1 come un nuovo regolatore post-trascrizionale di MCU e supportano l’idea che l’asse miR-1/MCU sia coinvolto nel rimodellamento ipertrofico fisiologico e patologico. Esperimenti futuri mireranno ad approfondire il ruolo causale di miR-1 nella modulazione di MCU, ed a identificare la via molecolare coinvolta nel processo. Attualmente esistono tools farmacologici (quali miR-mimics o antagomiRs) in grado di interagire coi miR endogeni, antagonizzandoli o sostituendoli, modulando con efficacia e selettività l’espressione degli mRNA target. Su queste basi, il nostro studio sull’asse miR-1/MCU può aprire a nuove prospettive terapeutiche per trattare l’ipertrofia cardiaca. 2. MCU partecipa all’adattamento cardiaco a stimoli ipertrofici. L’osservazione di come il contenuto di MCU cali durante la fase maladattativa dell’ipertrofia patologica, suggerisce che esso fluttui nelle varie fasi dell’ipertrofia. Questa osservazione ci ha indotto a cercare di determinare se MCU potesse avere un ruolo attivo nel rimodellamento cardiaco. Per testare quest’ipotesi, abbiamo modulato il livello di MCU in topi successivamente sottoposti a sovraccarico pressorio. Inoltre, per avere dettagli meccanicistici sul signalling cellulare, abbiamo modulato l’espressione di MCU in vitro, e abbiamo studiato l’effetto della sua overespressione o silenziamento nella risposta ad incubazione cronica con agonisti adrenergici. Per studiare il ruolo di MCU nell’adattamento cardiaco in vivo, abbiamo overespresso o silenziato l’uniporto mediante l’uso di vettori virali (AAV9). La modulazione di MCU, per sé, non ha alterato la struttura e la performance cardiaca. Tuttavia, quando abbiamo sottoposto gli animali a TAC, abbiamo osservato come l’overespressione di MCU comporti aumentata crescita ipertrofica, confrontando con animali WT allo stesso tempo dopo l’inizio della costrizione aortica. Inoltre, il rimodellamento nei topi overesprimenti ha caratteristiche simili a quello dell’ipertrofia fisiologica, quali aumentata densità capillare, scarsa fibrosi, funzionalità cardiaca preservata anche dopo 8 settimane di sovraccarico pressorio. Al contrario, il silenziamento di MCU ostacola l’adattamento cardiaco all’aumentata pressione, determinando un maladattamento prematuro, con caratteristiche tipiche della cardiomiopatia dilatativa, quali ridotta densità capillare, fibrosi diffusa ed inadeguata contrattilità. Queste caratteristiche hanno portato i topi MCU silenziati a sviluppare scompenso ed insufficienza cardiaca, ed a morire dopo solo 4 settimane dalla TAC. Per approfondire i meccanismi molecolari mediante i quali MCU impatta nella crescita ipertrofica dei cardiomiociti, abbiamo overespresso o silenziato MCU in cardiomiociti neonatali di ratto. Eseguendo esperimenti di live imaging delle dinamiche di Ca2+ mitocondriali con la sonda “mito-CaMeleon”, abbiamo appurato come la modulazione di MCU risulti in aumentato o diminuito uptake di Ca2+ mitocondriale. Se da un lato l’over-espressione di MCU non determina alterazioni morfologiche in condizioni basali, cellule silenziate dimostrano dimensioni maggiori rispetto a cellule di controllo, con evidente alterazioni nella struttura sarcomerica. Per mimare l’iperattivazione del sistema nervoso simpatico che si riscontra nell’ipertrofia sia fisiologica che patologica, abbiamo incubato le cellule con norepinefrina. Anche in questo caso, l’overespressione di MCU aumenta la crescita ipertrofica, mentre il suo silenziamento ha un effetto opposto, contraddistinto da compromissione dei sarcomeri ad attivazione di apoptosi, in evidente analogia ai dati ottenuti in vivo. Le successive analisi sono state mirate per approfondire lo stato di attivazione di divere vie di segnale medianti ipertrofia. Abbiamo rilevato come l’overespressione di MCU, in cardiomiociti sottoposti a stimolazione adrenergica, acceleri l’attivazione dell’asse calcineurina/NFAT. Inoltre, i nostri dati suggeriscono la partecipazione dell’asse Akt/ GSK3ß all’aumentata attivazione di NFAT, in una cascata presumibilmente a valle di CaMKII che fosforila Akt. Infatti, l’inibizione di CaMKII in cardiomiociti MCU overesprimenti determina una crescita ipertrofica comparabile a cellule di controllo. Per concludere, i nostri risultati dimostrano come l’aumento del carico cardiaco, indotto in vivo da TAC ed in vitro da trattamento con noradrenalina, sia ben tollerato quando i livelli di MCU sono aumentati dall’overespressione. Al contrario, il silenziamento di MCU induce, nelle stesse condizioni, morte cellulare e prematuro rimodellamento maladattativo. Questi dati sono in accordo con le nostre osservazioni preliminari che indicano come il contenuto proteico di MCU, che aumenta nell’ipertrofia compensata, diminuisca nel successivo rimodellamento patologico che determina scompenso cardiaco. Inoltre, abbiamo identificato l’asse ß-AR/CaMKII/Akt come cruciale nell’ipertrofia cardiaca e dipendente dalla modulazione di MCU. 3. Sviluppo di un protocollo di coltura che induca la maturazione di cardiomiociti neonatali in vitro Le colture primarie di cardiomiociti neonatali sono un modello cellulare ampiamente utilizzato nella cardiologia molecolare, in quanto possono esser mantenuti in coltura per più giorni e sono facilmente manipolabili geneticamente28. Tuttavia, questo tipo cellulare ha importanti differenze funzionali e strutturali rispetto ai cardiomiociti adulti. Queste differenze vanno dall’espressione di diverse isoforme di miosina (nel topo, dalla ß alla α), necessario per ottimizzare la performance contrattile, a cambi nel metabolismo (che passa da glucidico ad ossidativo), in modo da garantire maggior apporto di ATP in vista di un maggior consumo29. Inoltre, il processo di maturazione postnatale delle cellule comprende alterazioni nelle strutture coinvolte nelle dinamiche di Ca2+ 30. In particolare, nelle cellule neonatali, la contrazione avviene principalmente grazie al Ca2+ che entra dai canali del Ca2+ di tipo L situati nella membrana citoplasmatica. Il Ca2+ che entra attiva direttamente i sarcomeri, con un minimo contributo del Ca2+ contenuto nelle vescicole che costituiscono un immaturo reticolo sarcoplasmatico. Al contrario, nelle cellule adulte la membrana plasmatica ha sviluppato una serie di invaginazioni note come tubuli T che penetrano nella cellula e giungono all’estremità del reticolo sarcoplasmatico, ora costituito dal tipico sistema di cisterne, cosicché i canali del Ca2+ di tipo L siano a stretto contatto coi RyR2, formando cosi le Unità deputate al Rilascio del Ca2+ (CRUs). Questa sofisticata struttura fa sì che le poche molecole di Ca2+ che entrano dai canali nei tubuli T possano scatenare il Rilascio di Ca2+ indotto dal Ca2+ (CICR), determinando l’uscita di un’ingente quantità di ione dal reticolo sarcoplasmatico. Un altro importante cambiamento interessa i mitocondri che, se nel cardiomiocita neonatale occupano principalmente la zona perinucleare, in quello adulto si dispongono anche negli spazi sub-sarcolemmali ed inter-miofibrillari. In questi distretti, i mitocondri sono in prossimità del reticolo sarcoplasmatico, al quale possono ancorarsi fisicamente, trovandosi così in distretti cellulari caratterizzati da elevate concentrazioni di Ca2+. Tenendo a mente questi fattori, il nostro obiettivo è stato quello di sviluppare un protocollo che promuovesse la maturazione di cardiomiociti neonatali verso un fenotipo adulto, ottenendo così un modello sperimentale ottimale per lo studio delle dinamiche del Ca2+ cellulare, ed identificare così i meccanismi che connettono il Ca2+ mitocondriale al rimodellamento ipertrofico. Per indurre la maturazione dei cardiomiociti neonatali abbiamo modificato la composizione dei terreni di coltura tradizionalmente usati. Per mantenere le cellule ad una concentrazione di glucosio simile a quella fisiologica, abbiamo cambiato il costituente principale del terreno, passando da DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium) a MEM (minimum essential medium) e riducendo così la concentrazione da 25 mM a 5 mM, valore, quest’ultimo, paragonabile alla concentrazione fisiologica in vivo. Per ridurre la proliferazione dei fibroblasti, che tramite secrezione di fattori di crescita e componenti della matrice extracellulare determinerebbero de-differenziamento dei cardiomiociti, abbiamo fortemente ridotto il quantitativo di siero ed aggiunto un agente proliferativo (BrdU). Per compensare la rimozione del siero, abbiamo aggiunto co-fattori vitaminici ed ormoni trofici, come l’insulina. In tal modo abbiamo ottenuto una popolazione pura di cardiomiociti che può essere tenuta in coltura per più settimane, e che già dopo pochi giorni mostrano una morfologia diversa dalle cellule ottenute col protocollo tradizionale. Analisi alla microscopia hanno evidenziato come queste cellule siano più grandi, rettangolari con un asse maggiore ben distinto da un asse minore, ed un perimetro regolare senza le tipiche ramificazioni dei cardiomiociti immaturi neonatali. A livello subcellulare, abbiamo osservato una maggiore estensione dell’apparato contrattile, rivelatosi disposto in maniera più regolare. I mitocondri appaiono disposti longitudinalmente accanto e tra i sarcomeri, come nelle cellule adulte. Inoltre, l’immunofluorescenza per il recettore rianodinico ne ha evidenziato la presenza in clusters, distribuiti in maniera regolare, in analogia alla loro distribuzione in cellule mature, suggerendo così la presenza di un reticolo sarcoplasmatico maggiorente formato. Consistentemente con ciò, abbiamo osservato minori e più rapidi Ca2+ sparks, eventi elementari di dinamiche di calcio, determinati dall’apertura transiente di RyR. La minore frequenza ed entità di questi sparks suggerisce che i RyR disposti in maniera regolare in clusters determini la formazione di vere e proprie unità deputate al rilascio di calcio (Calcium Release Units, CRUs), strutture fondamentali nei cardiomiociti adulti. Infine, queste cellule han risposto maggiormente al trattamento con agonisti adrenergici, riportando una crescita ipertrofica maggiore rispetto a cellule neonatali tradizionali sottoposte allo stesso trattamento. Tutte queste caratteristiche sopracitate indicano come queste cellule possano rappresentare un modello in vitro adatto allo studio delle dinamiche di Ca2+ intracellulare, specialmente nel rimodellamento ipertrofico. È importante sottolineare come questo maggior grado di maturazione dei cardiomiociti neonatali non sia a discapito della capacità di manipolarli geneticamente, con tecniche di trasfezione od infezione. Esperimenti futuri cercheranno di caratterizzare a fondo le strutture coinvolte nelle dinamiche di calcio intracellulari, come ad esempio la formazione di Tubuli T ed il rapporto di questi con il reticolo sarcoplasmatico ed i mitocondri.