Protein kinase A in human glioblastoma non-stem and stem like cells: from transient interference to stable lentiviral-mediated downregulation of the regulatory subunit R2A

I gliomi sono i più frequenti tumori cerebrali a livello mondiale. Il glioblastoma è classificato dall'Organizzazione Mondiale della Sanità come glioma ad alto grado con prevalente differenziazione astrocitica ed è caratterizzato da elevata eterogeneità intratumorale, proliferazione microvascolare e grande capacità infiltrativa. Il glioblastoma è la forma più comune di glioma ed è attualmente associato ad una sopravvivenza media di soli 14 mesi dalla diagnosi. La terapia standard per questo tipo di tumore prevede la resezione chirurgica della massa tumorale, radioterapia e chemoterapia con l'agente alchilante temozolomide. Nonostante questo approccio aggressivo, il gliobastoma è ad oggi ancora considerato un tumore incurabile e meno del 5% dei pazienti sopravvive a cinque anni dalla diagnosi. Nei pazienti affetti da glioblastoma, le ricadute si verificano frequentemente e sono probabilmente dovute alla presenza di una sottopopolazione di cellule staminali tumorali, che rappresentano uno dei maggiori ostacoli alla terapia. È infatti noto che queste cellule sono resistenti a radioterapia e chemioterapia grazie alla loro plasticità, un'elevata capacità di riparare i danni al DNA, un'elevata espressione di proteine checkpoint che controllano la progressione del ciclo cellulare in risposta a danni genetici e di proteine che sono in grado di espellere all'esterno della cellula diverse molecole tra cui i farmaci. Proprio per queste caratteristiche di resistenza alle terapie convenzionali, le colture cellulari di cellule staminali tumorali sono oggi un modello in vitro riconosciuto per lo studio del glioblastoma e per l'identificazione di nuovi target terapeutici. Le cellule staminali tumorali vengono mantenute in particolari condizioni di coltura, che ne permettono la crescita selettiva sottoforma di aggregati sferici (sfere) in sospensione. Grazie alla ricerca scientifica, la conoscenza dell'eziopatogenesi dei gliomi è recentemente cresciuta e l'introduzione di marcatori molecolari, oltre ai criteri istologici per la classificazione dei gliomi, rappresenta un avanzamento verso una terapia molecolare personalizzata. Negli ultimi vent'anni, sono state sviluppate molte strategie terapeutiche innovative e sono stati identificati potenziali nuovi target tra i componenti delle vie di segnalazione intracellulari specificamente alterate nel glioblastoma. La maggior parte di questi nuovi approcci terapeutici è attualmente in fase di valutazione preclinica e clinica, i risultati sembrano promettenti, ma la complessità e l'eterogeneità dei gliomi sottolineano la necessità di cercare continuamente nuovi bersagli terapeutici. Proprio in questa direzione, la proteina chinasi A (PKA) è recentemente emersa per il suo coinvolgimento in molte caratteristiche distintive delle cellule tumorali e per le sue peculiarità nelle cellule di glioblastoma rispetto al parenchima cerebrale. PKA è un enzima che svolge molte funzioni all'interno della cellula e la cui attivazione dipende dal secondo messaggero cAMP. Nella sua forma inattiva PKA è un tetramero costituito da due subunità catalitiche e un dimero di subunità regolatorie. Fino ad oggi sono state identificate tre isoforme catalitiche e quattro isoforme regolatorie. Ciascuna subunità, sia catalitica che regolatoria, presenta un pattern di espressione specifico tra i diversi tipi cellulari e i diversi tessuti dell'organismo. La via mediata da cAMP/PKA regola una vasta gamma di processi cellulari, tra i quali il metabolismo, la progressione del ciclo cellulare, la proliferazione cellulare, la differenziazione cellulare, la trascrizione genica e l'apoptosi. La distribuzione isoforma-specifica di PKA e la sua regolazione spazio-temporale permettono un fine controllo dei segnali mediati dalla via di cAMP/PKA, che risulta essere di primaria importanza per il mantenimento di uno stato cellulare fisiologico. Infatti, molte alterazioni di PKA, come una sbilanciata espressione delle sue isoforme, una disregolazione della sua attività chinasica e la delocalizzazione dell'enzima stesso, sono state associate a molte malattie umane, compresi diversi tumori. In particolare, nel glioblastoma umano PKA è dieci volte più abbondante rispetto al cervello sano. Inoltre, nelle cellule di glioblastoma di roditore e umane la subunità regolatoria R2A di PKA presenta una peculiare localizzazione intracellulare sottoforma di cluster perinucleari co-localizzati con l'apparato di Golgi. Questa particolare distribuzione della subunità R2A non è stata riscontrata nel parenchima cerebrale, dove invece sono stati individuati aggregati delle subunità R1A e R2B. Il significato funzionale della proteina chinasi A associata all'apparato di Golgi non è ancora chiara, ma questa osservazione indica un potenziale ruolo della subunità R2A come marcatore tumorale o come nuovo target terapeutico. Sulla base di quanto esposto finora, questo progetto di dottorato ha lo scopo di approfondire il ruolo della proteina chinasi A, ed in particolare della subunità R2A, nel glioblastoma umano. Per questo motivo, lo studio della localizzazione intracellulare di R2A è stato esteso, per la prima volta, alle cellule staminali tumorali di glioblastoma. Esperimenti di immunofluorescenza hanno dimostrato che anche in queste cellule la subunità R2A presenta la stessa distribuzione intracellulare che era stata precedentemente descritta in linee cellulari e colture primarie non staminali di glioblastoma umano. Questa osservazione rafforza ulteriormente la peculiarità di R2A rispetto al parenchima sano e sottolinea la necessità di caratterizzare lo specifico ruolo funzionale di questa subunità. Al fine di sviluppare nuovi strumenti molecolari per lo studio di PKA, è stato generato un set di plasmidi ricombinanti per l'espressione delle subunità di PKA in fusione alla proteina verde fluorescente (EGFP). Questi plasmidi sono stati validati in cellule di glioblastoma umano e, nonostante la bassa efficienza di trasfezione, si sono rivelati degli utili strumenti per studi funzionali di PKA in vari modelli cellulari. Nella prima parte del progetto di ricerca sono inoltre stati analizzati in cellule di glioblastoma umano gli effetti di una interferenza transiente con la via di PKA. Alterazioni dell'attività, dell'espressione e della distribuzione intracellulare della proteina chinasi A sono state indotte mediante diversi approcci, come il trattamento con agenti chimici, la trasfezione con small interfering RNA (siRNA), l'overespressione di forme wild type e mutate delle subunità di PKA e l'espressione di peptidi inibitori che causano la delocalizzazione di PKA. Coerentemente con quanto riportato in letteratura, questi esperimenti hanno dimostrato che l'interferenza transiente con PKA può avere effetti diversi sulle cellule di glioblastoma umano, in particolare sulla loro vitalità e capacità migratoria. Come già riportato in altre linee cellulari umane, si è osservato che la ridotta espressione di PKA R2A indotta dalla trasfezione con siRNA induce la frammentazione dell'apparato di Golgi e la dispersione di R2A nel citoplasma delle cellule di glioblastoma, un effetto che deve essere ulteriormente approfondito. Per studiare più a fondo la relazione tra PKA R2A e apparato di Golgi, sono stati anche analizzati gli effetti indotti dall'interferenza con l'apparato di Golgi sulle cellule di glioblastoma e in particolare sulla localizzazione intracellulare di R2A. Il trattamento con brefeldina A, che distrugge la funzione dell'apparato di Golgi, causa un aumento della mortalità cellulare, riduce la motilità e induce la ridistribuzione della subunità R2A nel citosol delle cellule di glioblastoma. Questi risultati sono a sostegno dell'importante relazione tra PKA R2A e l'apparato di Golgi, ma ulteriori studi sono necessari per comprenderne meglio il significato funzionale. La seconda parte del progetto di ricerca riguarda lo sviluppo di un sistema basato su vettori lentivirali di terza generazione per la riduzione dell'espressione della subunità R2A di PKA mediante short hairpin RNA (shRNA). Sono quindi stati generati dei vettori lentivirali per l'espressione di shRNA aventi come bersaglio diversi esoni del gene di R2A, per la co-espressione degli stessi shRNA e del gene reporter EGFP e per l'espressione di uno shRNA scrambled per la valutazione di eventuali effetti off-target. Tutti i vettori sono stati validati sia in cellule non staminali che in cellule staminali di glioblastoma umano, dimostrandosi in grado di indurre un silenziamento efficiente e stabile dell'espressione di R2A in entrambi i tipi di colture cellulari. Esperimenti preliminari hanno inoltre valutato gli effetti del silenziamento della subunità R2A sulla proliferazione e sulla morte cellulare. Per quanto riguarda le cellule non staminali di glioblastoma umano, i dati ottenuti sono controversi a causa di una possibile citotossicità della sequenza scrambled, che non era stata rilevata dalla precedente validazione bioinformatica e che è tuttora in fase di studio. Al contrario, nelle cellule staminali di glioblastoma la stessa sequenza scrambled non risulta essere tossica in quanto non induce una riduzione della vitalità cellulare rispetto alle cellule non trasdotte. Ancora più interessante è l'osservazione che le cellule staminali di glioblastoma con una ridotta espressione di R2A dovuta alla trasduzione con il vettore recante la sequenza shRNA contro il gene di R2A, presentano una distribuzione di cellule vive/morte significativamente diversa, nello specifico un aumento della morte cellulare, rispetto alle cellule trasdotte con il vettore scrambled. Questi risultati suggeriscono quindi una potenziale relazione tra il silenziamento della subunità R2A e la sopravvivenza delle cellule staminali di glioblastoma, un aspetto che merita di essere ulteriormente approfondito. In conclusione, questo progetto di dottorato ha indagato le molteplici funzioni di PKA nel glioblastoma umano, attraverso approcci tra loro complementari e diversi modelli in vitro. È stato dimostrato che l'interferenza transiente con la via di PKA può avere effetti anti-tumorali sulle cellule di glioblastoma. Dati preliminari indicano anche una possibile relazione tra la riduzione dell'espressione della subunità R2A e la crescita delle cellule staminali di glioblastoma. Inoltre, è stato messo a punto un sistema lentivirale per il silenziamento efficiente e stabile di PKA R2A. Questo strumento è stato validato con successo nelle cellule di glioblastoma umano e può essere considerato uno strumento promettente per futuri studi della proteina chinasi A in diversi modelli cellulari.