Apoplastic glutathione degradation by gamma-glutamyl transferase isoforms GGT1 and GGT2 is important for generative and vegetative development in Arabidopsis thaliana

La gamma-glutammil transferasi (GGT) è l’unico enzima in grado di degradare il glutatione (GSH) nelle regioni extra citosoliche. Le isoforme GGT1 e GGT2, nelle cellule vegetali, sono localizzate nell’apoplasto; ancorate rispettivamente alla parete cellulare e alla membrana plasmatica. La GGT1 è espressa in complesso in tutta la pianta, principalmente nelle foglie e nel sistema vascolare; mentre la GGT2 ha un’espressione più specifica e la si trova principalmente nei semi, nei tricomi, nel polline e in misura minore nelle radici. Tuttavia il loro ruolo nella fisiologia vegetale non è ancora stato chiarito. Il glutatione, substrato della GGT, è una delle molecole più versatili in biologia; infatti è tra i più importanti regolatori dello stato redox cellulare e nelle piante una delle principali fonti di zolfo ridotto. Il glutatione è un normale costituente della linfa nel floema, ma i meccanismi del suo caricamento e scaricamento floematico non sono ancora chiari. Ottenere e caratterizzare un doppio mutante ggt1/ggt2 RNAi permetterebbe di aggiungere più informazioni rispetto a quelle fornite dai singoli mutanti, evitando inoltre possibili meccanismi compensatori tra le due isoforme. In questo lavoro sono state selezionate e caratterizzate le linee ggt1/ggt2 RNAi, generate già in precedenza. Il livello di silenziamento di entrambi i trascritti GGT1 e GGT2 è stato verificato mediante qRT-PCR e l’attività totale della GGT è stata quantificata. Inoltre è stata condotta una caratterizzazione fenotipica; in primo luogo è stato studiato il contributo che potrebbe avere la GGT nel rilasciare cisteina al seme e in particolare la sua rilevanza nello sviluppo e nella composizione del seme. Le piante ggt1/ggt2 RNAi hanno mostrato una minore produzione di semi dovuta al ridotto numero di silique e della loro lunghezza. Tuttavia nessun cambiamento è stato riscontrato nel contenuto di tioli e nelle proteine di riserva albumina 2S dei semi mutanti. In conclusione il silenziamento della GGT induce un riaggiustamento metabolico che porta ad una redistribuzione delle risorse in un numero inferiore di semi, ma quanto meno vitali. Il fatto che la GGT usi il GSH come substrato solleva la questione sul fatto che l’alterata ridistribuzione delle risorse sia dovuto o a deficit nel rilasciare cisteina ai tessuti/cellule sink, o a scompensi redox che possono portare ad alterazioni nel metabolismo del glutatione. Quest’ultima possibilità potrebbe essere correlata con l’accumulo di prolina rilevato nei semi ggt1/ggt2 RNAi, suggerendo la presenza di uno stress ossidativo che va influenzare negativamente anche il tasso di germinazione, risultato ritardato. Anche la crescita vegetativa ggt1/ggt2 RNAi è risultata leggermente rallentata con una riduzione del diametro della rosetta e della lunghezza delle radici. I tricomi, i peli fogliari caratterizzati da alti livelli di GSH, erano anch’essi in numero minore rispetto al wild-type. Inoltre nei mutanti ggt il consumo di GSH da parte delle radici suggerisce una cooperazione tra le due isoforme. In conclusione il contemporaneo silenziamento di GGT1 e GGT2 induce una riduzione nel numero degli organi che hanno un’alta domanda di GSH (semi e tricomi), uno stress ossidativo nei semi e in misura minore influenza la crescita vegetativa. Nuove interessanti informazioni sulle GGT potranno essere estrapolate tramite lo studio dei doppi mutanti generati in questo lavoro, ottenuti incrociando i mutanti ggt con sir1-1, il quale ha un ridotto flusso di zolfo, o con ggct2;1, nel quale manca la degradazione citosolica del GSH.