Development of superior yeast strains for the production of bioethanol from multiple waste streams: a combination of classical and modern genetic approaches

Climate change is demanding a reduction in the usage of fossil fuels and shifts to cleaner and greener alternatives. The abundance of agricultural waste streams serves as a renewable resource for biofuel production. Amongst all agricultural crops, rice is one of the most largely grown crops, and more than 4.8 % of the total production goes to waste at different stages from farm to fork. This study was intended to review all the rice waste streams including starchy and lignocellulosic wastes to convert them biotechnologically into liquid (bioethanol, biobutanol, biodiesel), and gaseous (biogas, biohydrogen) biofuels through the use of pure or mixed microbial cultures. Importantly, the global accessibility of each rice byproduct like rice husk, rice straw, broken rice, discolored rice, unripe rice, has also been investigated. One of the focuses of the study was to identify and establish the potential of rice waste as a ‘fuel farm’ with detailed attention given on bioethanol. The physical, chemical, enzymatic, or microbial pretreatments, were studied in depth as their role in making carbon available for enzymatic hydrolysis and fermentation play an important role. Although much research has already been done, further research is still required for their up-scale and industrial commercialization. Moreover, future process integrations will open the platform to biorefinery schemes where rice waste streams can be processed into multiple biofuels and other added-value products, towards the full exploitation of the feedstocks and the economic and environmental sustainability of the overall process. Considering this landscape of opportunities, unripe rice, the least explored rice mill byproduct, was employed for the integrated biofuel production approach. 1 L scale fermentation trials were carried out for the first time using unripe rice as a substrate. Comparison of enzymatic hydrolysis between recently developed recombinant Consolidated Bioprocessing (CBP) strains were performed and the most efficient recombinant yeast S. cerevisiae ER T12.77 showed outstanding performances with hydrolysis similar to those of the commercial enzymatic cocktail STARGENTM 002. Another CBP strain, S. cerevisiae ER T12 showed great hydrolysis yields. Similar results were observed during the fermentation 10 experiment where ER T12.7 showed the highest ethanol yield from 20% w/v unripe rice. In a biorefinery context, the spent CBP fermentation slurries from ER T12.7 and ER T12 were then distilled to remove ethanol and further exploited for biogas production, both yielding 372 and 370 mL CH4/g VS, respectively. With this integrated approach, maximum carbon was utilized to produce liquid and gaseous biofuel which helped to make the production of biofuel commercially viable. While unripe rice is an agricultural byproduct, domestic waste generated on daily basis is another source of carbon that has the potential to be transformed into biofuel. For the first time, the organic fraction of municipal solid waste (OFMSW) was employed for biofuel production using highly efficient amylolytic CBP yeast. Aiming for this opportunity, the OFMSW sample (separated at source) was hand segregated to obtain the compositional structure of different fractions. Attention was also given to seasonal variation in fractions, mainly bread and pasta fraction, and winter conditions were simulated during the fermentation of OFMSW to ethanol by the efficient amylolytic CBP strain ER T12.7 which was then compared to non-amylolytic parental strain ER V1. As expected, ER V1 could hardly produce any ethanol from available free sugars while a high titer of ethanol was produced by ER T12.7. As the concentration of starch increased, higher productivity was achieved by ER T12.7. Presence of the rice mill in the proximity of the OFMSW management site considered in this study encouraged to co-ferment discolored rice, an underutilized rice mill byproduct, along with OFMSW.

Il cambiamento climatico richiede una riduzione dell'uso di combustibili fossili e il passaggio ad alternative più pulite e più ecologiche. L'abbondanza di flussi di rifiuti agricoli funge da risorsa rinnovabile per la produzione di biocarburanti. Tra tutte le colture agricole, il riso è una delle colture più coltivate e oltre il 4,8% della produzione totale va sprecato in diverse fasi dal campo alla tavola. Questo studio aveva lo scopo di esaminare tutti i flussi di rifiuti di riso, compresi i rifiuti amidacei e lignocellulosici, per convertirli biotecnologicamente in biocarburanti liquidi (bioetanolo, biobutanolo, biodiesel) e gassosi (biogas, bioidrogeno) attraverso l'uso di colture microbiche pure o miste. La presente tesi di dottorato, in primo luogopassa in rassegna per la prima volta gli approcci biotecnologici per convertire tutti gli scarti del riso in biocarburanti liquidi e gassosi. Uno degli obiettivi dello studio era identificare e stabilire il potenziale dei residui di riso in bioetanolo. I pretrattamenti fisici, chimici, enzimatici o microbici sono stati studiati in modo approfondito in quanto il loro ruolo nel rendere disponibile il carbonio per l'idrolisi enzimatica e la fermentazione giocano un ruolo decisivo Future integrazioni di processo apriranno la piattaforma a schemi di bioraffineria in cui i flussi di scarti di riso possono essere trasformati in molteplici biocarburanti e altri prodotti a valore aggiunto, verso il pieno sfruttamento delle materie prime e la sostenibilità economica e ambientale del processo complessivo. Considerando questo panorama di opportunità, il riso immaturo (detto anche grana verde), il sottoprodotto della riseria finora meno esplorato in letteratura, è stato impiegato per l'approccio integrato alla produzione di biocarburanti. Per la prima volta sono state effettuate prove di fermentazione su scala 1 L utilizzando grana verde come substrato. La capacità idrolitiche di alcuni ceppi per il Consolidated Bioprocessing da amido, come S. cerevisiae ER T12.7 e ER V1 sono state confrontate con quelle del cocktail enzimatico commerciale STARGENTM 002. ER T12.7 ha mostrato un'idrolisi comparabile con 100% STARGENTM 002, mentre ER T12 ha mostrato un'idrolisi simile a quella del 50% STARGENTM 002. Risultati simili sono stati osservati durante l'esperimento di fermentazione in cui ER T12.7 ha mostrato la più alta resa in etanolo da 200 g/L di grana verde. In un approccio di bioraffineria, i residui di fermentazione CBP di ER T12.7 e ER T12 sono stati distillati per rimuovere l'etanolo e ulteriormente sfruttati per la produzione di biogas, ottenendo rispettivamente 372 e 370 mL CH4/g VS. Con questo approccio integrato, il carbonio massimo è stato utilizzato per produrre biocarburanti liquidi e gassosi che hanno contribuito a rendere commercialmente fattibile la produzione di biocarburanti. Mentre il riso immaturo è un sottoprodotto agroindustriale, i rifiuti domestici generati quotidianamente sono un’altra fonte di carbonio che ha il potenziale per essere trasformato in biocarburante. La frazione organica dei rifiuti solidi urbani (FORSU) è una fonte economica, abbondante e ricorrente di carbonio fermentabile che è stata impiegata per la prima volta in questa sede per la produzione di bioetanolo utilizzando il lievito CBP amilolitico ER T12.7. È stata prestata attenzione alla variazione stagionale delle frazioni, principalmente la frazione di pane e pasta, e le condizioni invernali sono state simulate durante la fermentazione di FORSU in etanolo mediante un efficiente ceppo CBP amilolitico ER T12.7 che è stato poi confrontato con il ceppo parentale non amilolitico S. cerevisiae ER V1. Come previsto, ER V1 difficilmente potrebbe produrre etanolo dagli zuccheri liberi disponibili mentre un titolo elevato di etanolo è stato prodotto da ER T12.7. Con l'aumentare della concentrazione di amido, è stata raggiunta una maggiore produttività da ER T12.7.