Microstructured polymeric substrates applied to human stem cells studies

Le cellule staminali sono cellule non specializzate che hanno la capacitá di differenziare dando origine a diversi tipi di linee cellulari presenti nel corpo umano. L’impiego di cellule staminali permette di effettuare studi biologici, fsiologici, di ingegneria tissutale e di medicina rigenerativa su cellule umane derivate dalle staminali stesse. Tali studi sono spesso svolti in vitro. Quando si realizzano test in vitro é di fondamentale importanza tenere conto che i fenomeni di adesione, migrazione, crescita ed espressione genica a livello cellulare sono controllati o influenzati anche dalla tipologia di interazione che intercorre tra cellula e ambiente circostante. L’ambiente cellulare non puó essere riprodotto totalmente in laboratorio, tuttavia la microtecnologia permette di progettare e realizzare ambienti di coltura cellulare complessi. In questo lavoro vengono utilizzati substrati polimerici microstrutturati e fotopolimerizzati per realizzare un ambiente cellulare tridimensionale progettato dal punto di vista morfologico e chimico. La combinazione dell’aspetto morfologico e chimico induce particolari risposte cellulari e permette di individuare e analizzare determinati comportamenti cellulari in cellule staminali sia pluripotenti che differenziate. In particolare, tali substrati vengono impiegati per studiare la deformabilitá del nucleo delle cellule sotto esame, dato il fondamentale ruolo del nucleo nel determinare la funzione, lo sviluppo e i possibili aspetti patologici a livello cellulare. L’obiettivo del nostro studio sui nuclei é quello di determinare se variazioni della morfologia del nucleo (indotte dalla specifica struttura tridimensionale dei substrati utilizzati per svolgere gli esperimenti) in cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs), possano influenzare il normale comportamento e sviluppo cellulare. Per indurre variazioni morfologiche a livello nucleare si utilizzano substrati caratterizzati da micropillars aventi una distanza da pillar a pillar inferiore alla dimensione media dei nuclei. La deformabilitá nucleare é quantificata a partire da immagini acquisite al microscopio confocale tramite utilizzo di semplici algoritmi che analizzano la forma dei nuclei. La nostra analisi mostra come la morfologia dei nuclei di hPSCs sia notevolmente alterata rispetto alla fisiologica forma rotondeggiante quando tali cellule vengono coltivate su sibstrati microstrutturati. Al contrario le cellule differenziate mostrano una deformabilitá molto piú bassa. Per ottenere informazioni relative ad una possibile relazione tra morfologia nucleare e funzione cellulare, la deformabilitá cellulare é quantificata nei diversi stadi di differenziamento. Inoltre, la morfologia cellulare e l’espressione di alcuni geni viene confrontata tra cellule differenziate su substrati microstrutturati e tra cellule differenziate su substrati piatti. I nostri dati mostrano che la pluripotenza cellulare è mantenuta quando le cellule vengono coltivate su substrati microstrutturati cosí come quando vengono coltivate su substrati piatti. Al contrario, l’analisi dell’espressione genica realizzata su cellule dove é stato indotto il processo di sviluppo dei foglietti germinali (endoderma, ectoderma e mesoderma), rivela che la riorganizzazione morfologica dei nuceli osservata nel caso di cellule coltivate su substrati microstrutturati, puó ostacolare un normale processo di induzione del foglietto germinale endoderma che sembra essere ostacolato dalla deformazione dei nuclei. Il processo di specializzazione cellulare in ectoderma e mesoderma avviene invece anche nel caso di cellule seminate su substrati microstrutturati dove i nuclei assumono forti deformazioni morfologiche. Tuttavia il processo di differenziamento in ectoderma avviene in concomitanza con un processo di irrigidimento del nucleo che assume forme tondeggianti e non é piú in grado di adattarsi alla geometria del substrato. Questo irrigidimento del nucleo deve essere correlato ad un processo di riorganizzazione strutturale e funzionale a livello della membrana cellulare e del citoscheletro. Il nostro studio mostra come combinando l’utilizzo di substrati microstrutturati ad un semplice processo di analisi delle immagini dei nuclei acquisite al confocale, si possono monitorare e quantificare facilmente e in maniera affidabile variazioni della deformabilità nucleare. Questo approcio, se combinato ad una piú ampia analisi dell’espressione genica a livello cellulare, potrá permettere di correlare variazioni della morfologia nucleare a variazioni funzionali e di espressione genica a livello cellulare. La combinazione di substrati microstrutturati con l’analisi di immagini acquisite al confocale viene utilizzata anche per un secondo obiettivo. Abbiamo realizzzato una piattaforma in grado di quantificare importanti parametri fisiologici di cardiomiociti derivati dal differenziamento di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC-CMs). Tale piattaforma é in grado di ottenere in maniera simultanea la dinamica del calcio e la forza di contrazione dei cardiomiociti. I cardiomiociti, grazie alla specifica chimica della superficie del substrato, assumono una forma allungata, simile a quella fisiologica, una volta seminati. Il substrato é stato realizzato in un elastomero fotopolimerizzabile, che promuove l’adesione cellulare. Tale polimero é costituito da n-butilacrilato e da metacriloil-4-oxi-benzofenone P(n-BA-co-%MABP). Con questo polimero sono stati realizzati substrati microstrutturati che presentano dei micropillar. Un sottile strato di poliacrilamide (PAA) é stato poi fotopolimerizzato tramite esposizione alla luce UV su tutto il substrato, eccetto che in aree rettangolari che si estendono da un micropillar all’altro. I nostri dati mostrano che quando gli hPS-CMs vengono mantenuti in coltura sui nostri substrati per 5 settimane la durata del transiente del calcio diminuisce mentre la forza di contrazione aumenta rispetto alle stesse cellule mantenute in coltura per 1 settimana. Tali dati suggeriscono che la combinazione di diversi fattori quali la morfologia della cellula, il tempo di coltura e lo stimolo meccanico dato dai micropillar elastici inducono un processo di maturazione funzionale a livello cellulare. L’impiego della microtecnologia per realizzare un ambiente cellulare ad hoc combinato con l’impiego di cellule staminali va nella direzione di realizzare test in vitro sempre piú complessi e che possano dare informazioni sempre piú specifiche e affidabili. Tale approccio puó permettere la riduzione di test in vivo che sono molto piú costosi, eticamente problematici e basati sul modello animale, che spesso presenta sostanziali differenze rispetto a quello umano