Conformational switch of oncogene promotorial sequences towards non-canonical DNA secondary structures

Molti studi dimostrano che l’assunzione di strutture “non canoniche” da parte della molecola di DNA sia coinvolto in molti importanti processi biologici che regolano la proliferazione cellulare e l’espressione proteica. In particolare, è stata dimostrata l’implicazione di una di queste particolari strutture secondarie, chiamata G-quadruplex (G4), nel blocco della progressione del cancro. La struttura G4 è propria di sequenze di DNA ricche in guanine consecutive che assemblandosi tramite legami di Hoostein, formano piani di tetradi di guanine impilati tra loro. Questa particolare conformazione si forma prevalentemente lungo i tratti terminali dei cromosomi, i telomeri, ma anche lungo siti promotoriali di diversi oncogeni coinvolti in molti tipi di cancro. La formazione del G4 porta ad una sorta di ingombro sulla molecola di DNA che inibisce l’elongazione del telomero e i processi di trascrizione. Questo porta ad uno “spegnimento” di questi meccanismi che sono direttamente coinvolti nello sviluppo del cancro. Molti fattori possono influenzare gli equilibri delle conformazioni G4, per esempio, le condizioni saline, la temperatura, il pH, il legame con specifiche proteine, così come la presenza di cosoluti. Inoltre, la struttura globale del G4 é rigorosamente dipendente dalla sequenza oligonucleotidica. Pertanto, diverse strutture G4 possono essere identificate a livello cellulare. In questo progetto, è stato condotto uno studio conformazionale di regioni promotoriali degli oncogeni EGFR e BRAF, dal momento che, su questi oncogeni è stata riscontrata la presenza di regioni “G-rich” (ricche in guanine) potenzialmente in grado di assumere una struttura G4. In particolare, sono state analizzate le sequenze a partire dalle posizioni -272, -37 di EGFR e -176 di BRAF dal “transcription start site” (sito di inizio della trascrizione). Finora, non sono presenti dati in letteratura riguardanti la caratterizzazione strutturale di queste sequenze in soluzione. Con questo studio, è stata dimostrata la capacità delle suddette sequenze di assumere una conformazione G4 nelle idonee condizioni sperimentali e soprattutto in un ambiente che mimi quello fisiologico (150mM KCl e pH 7.5). Poiché gli oncogeni sono sequenze a doppio filamento, anche la conformazione i-motif assunta dal filamento complementare ricco in citosine (“C-rich”) può essere coinvolta nella regolazione del processo di trascrizione genica. Tuttavia, sinora non è stata riscontrata alcuna rilevanza fisiologica della conformazione i-motif. In questo lavoro, è stata caratterizzata anche la conformazione assunta dal filamento “C-rich”, in particolare se essa possa esistere in condizioni fisiologiche e se fosse in grado di destabilizzare la doppia elica insieme al G4. I dati ottenuti dimostrano che in condizioni fisiologiche la forma prevalente è il doppio filamento. Tuttavia, è stato dimostrato come alcuni ligandi siano in grado di spostare l’equilibrio del DNA dalla sua forma di doppia elica-B, verso le conformazioni non canoniche. È stato infatti condotto uno studio su due librerie di composti con lo scopo di evidenziare un composto selettivo ed efficace. Ci siamo focalizzati su derivati antrachinonici e di naftalendiimidi noti come efficaci ligandi per il G4. Questi composti sono stati prima testati su diversi templati G4, noti per essere dei modelli validati per lo studio di binding sul G4. Quindi la loro efficienza sul G4 è stata poi comparata a quella sul doppio filamento. I derivati più selettivi verso il G4 sono stati poi testati su G4 oncogenici. Sebbene una continuazione dello studio fosse necessaria per identificare un composto “lead”, con questo lavoro è stato dimostrato come l’uso di una sostituzione asimmetrica sull’anello aromatico possa implementare la selettività tra più G4. Infine, per identificare la formazione del G4 in vivo, è stata messa a punto una nuova tecnica che consiste in un protocollo di footprinting in vivo. Questo lavoro, svolto nell’Università del Mississippi, Oxford, MS (USA) sotto la supervisione della dr.ssa Tracy A. Brooks, dovrebbe fornire nuovi sviluppi per la formazione del G4 nelle cellule in accordo con le loro condizioni fisiologiche