Superoxide radical dismutation as protective mechanism to hamper the progression of Parkinson's disease

Riassunto La malattia di Parkinson è una sindrome neurologica degenerativa, caratterizzata dalla perdita preferenziale dei neuroni dopaminergici della Substantia Nigra pars compacta. Questa patologia è attualmente incurabile e le terapie convenzionali agiscono esclusivamente sui sintomi migliorando la qualità della vita. Pertanto, è necessario identificare nuove strategie terapeutiche che non solo forniscano un efficacie trattamento della sintomatologia ma agiscano anche ritardando i danni neuronali e arrestando la progressione della malattia. Sebbene l'eziologia è tuttora sconosciuta, lo stress ossidativo sembra svolgere un ruolo chiave nella degenerazione dopaminergica sia nella forme sporadiche che familiari della patologia. In particolare, la selettiva vulnerabilità di tali neuroni allo stress ossidativo potrebbe essere associata al metabolismo della dopamina (DA), evento molecolare citosolico responsabile, esso stesso, della sovrapproduzione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) L'ipotesi principale alla base di questa tesi è che l'inibizione della produzione di ROS possa ritardare, arrestare o prevenire il processo neurodegenerativo che si verifica nei pazienti affetti dal morbo di Parkinson. In questo scenario, il nostro progetto si propone di studiare in vitro e in vivo il potenziale ruolo protettivo delle superossido dismutasi (SOD) e di composti che ne mimano l'attività (SOD mimetici) contro i danni ossidativi, correlati a tale patologia, utilizzando due diversi paradigmi sperimentali. La scelta di studiare questi enzimi è legata alla loro funzione cellulare antiossidante, cruciale nel promuovere l'eliminazione dell'anione superossido, radicale capostipite nella produzione a valle di specie molto pi๠tossiche e reattive. In questo studio, il primo paradigma utilizzato è l'erbicida paraquat (PQ), il cui meccanismo di tossicità si basa sulla produzione di stress ossidativo. L'esposizione cronica a tale molecola è stata correlata epidemiologicamente all'insorgenza delle forme sporadiche di Parkinson. Il secondo modello adottato si basa sulla deficienza della chinasi PINK1, responsabile di una forma familiare della malattia. Infatti, mutazioni a carico del gene PINK1 sono state identificate come causa di parkinsonismo giovanile precoce. Questa proteina sembra svolgere un ruolo chiave nel mitochondrial quality control e nella regolazione dello stress ossidativo. Al fine di studiare la potenziale azione protettiva delle SOD contro la tossicità esercitata dal PQ o indotta dall'assenza di PINK1, l'isoforma citosolica e quella mitocondriale, rispettivamente SOD1 e SOD2, sono state sovraespresse nelle cellule di neuroblastoma umano SH-SY5Y e in Drosophila melanogaster. In vitro e in vivo, esclusivamente la sovraespressione dell'isoforma mitocondriale ha evidenziato un effetto protettivo contro l'esposizione acuta al PQ. La selettività osservata potrebbe essere associata ad un meccanismo di tossicità intrinseco dell'erbicida che, ad elevate dosi, comprometterebbe fortemente i mitocondri, aumentando la produzione di ROS in questi organelli e promuovendone la frammentazione. Al contrario, in Drososphila, l'enzima citosolico SOD1 è in grado di migliorare le performance motorie, alterate dall'esposizione cronica al PQ. Tale effetto è stato rilevato anche quando la sovraespressione era indotta esclusivamente a livello dei neuroni dopaminergici. Le nostre osservazioni indicano che in tali condizioni il compartimento citosolico potrebbe essere particolarmente compromesso, suggerendo che nei neuroni dopaminergici il citosol possa essere la sede di altri meccanismi ossidativi, tra i quali il metabolismo della DA, in grado di amplificare o esacerbare lo stress ossidativo indotto dal PQ, rendendo tali cellule particolarmente vulnerabili. In cellule SH-SY5Y, la deficienza di PINK1 ha causato un fenotipo mitocondriale caratterizzato dalla frammentazione del network di questi organelli. Anche in questo caso, le SOD hanno svolto una funzione protettiva contrastando la frammentazione mitocondriale osservata. Tuttavia, mentre la sovraespressione della SOD1 ha ridotto solo parzialmente il danno, la SOD2 è apparsa in grado di garantire il mantenimento di un corretto network mitocondriale. In Drosophila, la perdita di PINK1 promuove una severa disabilità motoria, la quale puಠessere migliorata dall'attività dell'isoforma citosolica SOD1, suggerendo che PINK1 possa essere coinvolta in altri processi molecolari non strettamente correlati col mantenimento del funzionamento mitocondriale. Dimostrata l'azione protettiva delle SOD, abbiamo deciso di studiare il potenziale utilizzo terapeutico del SOD mimetico M40403. I risultati delle nostre analisi hanno evidenziato che tale molecola svolga un'attività antiossidante, in vitro e in vivo, proteggendo dal danno ossidativo indotto dal trattamento acuto e cronico con l'erbicida PQ. Inoltre, il composto M40403 è stato testato in modelli cellullari e animali privi di PINKI1 nei quali ha migliorato, rispettivamente, il fenotipo mitocondriale e i difetti nell'apparato locomotore. Infine la somministrazione di questo SOD mimetico in linee di Drosophila deficienti per SOD1 o SOD2, ha rivelato che la molecola possa sopperire parzialmente all'assenza di ciascun enzima, supportando l'ipotesi che possa agire sia a livello citosolico che mitocondriale. Complessivamente, i dati ottenuti finora hanno dimostrato che l'utilizzo di specifici composti SOD mimetici, in particolare M40403, possa essere efficacie nel contrastare danni ossidativi. Questi composti dovrebbero essere ulteriormente studiati al fine di identificare un possibile agente terapeutico per la malattia di Parkinson. Parallelamente al progetto appena descritto, ci siamo focalizzati su un seconda linea di ricerca volta alla caratterizzazione dei due linee di neuroblastoma umano al fine di definire quali, tra queste, rappresenti il modello cellulare pi๠attendibile per lo studio della malattia di Parkinson. I modelli cellulari sono largamente utilizzati nello studio in vitro dei meccanismi molecolari alla base della degenerazione dei neuroni dopaminergici. Nonostante il loro utilizzo presenti grandi vantaggi, queste linee cellulari non sempre ricapitolano le proprietà morfologiche e neurochimiche dei suddetti neuroni. Pertanto, considerando il ruolo del metabolismo della DA nell'eziologia del morbo di Parkinson, l'acquisizione del fenotipo dopaminergico risulta essere un requisito importante. In particolare, le linee cellulari di neuroblastoma sono spesso usate come modello, nonostante siano proliferanti, non esprimano markers caratteristici dei neuroni maturi e siano in grado di sintetizzare diversi neurotrasmettitori, in particolare le catecolamine DA e noradrenalina (NA). Per queste ragioni, abbiamo studiato l'abilità di tre differenti agenti, il 12-O-tetradecanoilforbolo-13-acetato (TPA), l'acido retinoico (RA) e la staurosporina, nel guidare il differenziamento delle cellule SH-SY5Y e BE(2)-M17 verso un fenotipo dopaminergico. La prima di queste linee cellulari è ampiamente utilizzata e studiata, nonostante il fenotipo acuisito dopo il differenziamento sia ancora un argomento dibattuto. Al contrario, la seconda è stata finora poco caratterizzata e potrebbe rappresentare un valido sistema cellulare alternativo. In questa tesi, al fine di valutare l'acquisizione delle caratteristiche neuronali, abbiamo inizialmente analizzato l'effetto indotto dai tre agenti sull'inibizione della crescita, morfologia cellulare e espressione di markers neuronali. I nostri risultati hanno dimostrato che il trattamento con staurosporina e RA siano i pi๠efficienti nell'arrestare la proliferazione cellulare rispettivamente nelle cellule SH-SY5Y e BE(2)-M17. Inoltre, in entrambe le linee, RA e staurosporina promuovono la formazione di un compresso network di ramificazioni neuritiche e l'espressione di specifici markers neuronali citoscheletrici. Per studiare l'effetto del differenziamento nell'acquisizione di un fenotipo dopaminergico o noradrenergico nei due modelli cellulari, abbiamo valutato il profilo di espressione dei geni principalmente coinvolti nella sintesi di entrambi i neurotrasmettitori e i loro contenuto intracellulare. In cellule SH-SY5Y, il trattamento con RA e TPA è risultato in grado di promuovere non solo la down-regolazione dei geni analizzati ma anche una consistente riduzione del contenuto di DA e NA, suggerendo la perdita del fenotipo catecolaminergico. Al contrario, la staurosporina ha evidenziato la capacità di up-regolare l'espressione genica degli enzimi coinvolti nella sintesi dei due neurotrasmettitori e di incrementare il contenuto di NA, amplificando il fenotipo noradrenergico di questo modello. Nella linea cellulare BE(2)-M17, i livelli di DA and NA rilevati prima del differenziamento risultano essere considerevolmente elevati rispetto a quelli misurati nelle SH-SY5Y, evidenziando che la prima abbia un fenotipo catecolaminergico molto pi๠pronunciato della seconda. Quest'ultimo non viene sostanzialmente alterato dai trattamenti con TPA e RA, mentre il differenziamento con staurosporina è nuovamente in grado di up-regolare il profilo di espressione analizzato e di promuovere un'ulteriore sintesi di DA e NA, determinando l'acquisizione di un fenotipo ulteriormente marcato. Concludendo, i risultati di questo studio indicano che la linea BE(2)-M17 possa essere un modello sperimentale alternativo con proprietà neurochimiche differenti dalle SH-SY5Y, suggerendo l'applicazione delle due line cellulari in differenti campi di ricerca.