Functional studies on autoinflammatory diseases, focusing in particular on Blau syndrome

SCOPO DEL LAVORO Le malattie autoinfiammatorie sono patologie caratterizzate da episodi infiammatori recidivanti a carico di differenti organi. In esse non vi è apparente coinvolgimento di autoanticorpi nè di linfociti T antigene specifici, ma disregolazione della risposta immunitaria innata. La Sindrome di Blau (BS) è una rara malattia autoinfiammatoria autosomica dominante caratterizzata dal punto di vista clinico da artrite simmetrica, dermatite granulomatosa e uveite ricorrente. La malattia è causata da singole mutazioni nel gene CARD15/NOD2, codificante la proteina NOD2 che è nota regolare il pathway di difesa da patogeni attivando la via del segnale NF-κB. In questo studio è stata effettuata dapprima una serie di analisi funzionali volte a caratterizzare la mutazione p.E383K ritrovata in un'unica famiglia italiana affetta da sindrome di Blau. Dopo lo studio in vitro della proteina NOD2 mutata, si è voluta approfondire l’attività di NF-κB e la secrezione di citochine pro-infiammatorie sia ex vivo che in vitro. Nella seconda parte della tesi, si sono volute studiare nel dettaglio sia le vie del segnale note essere implicate nell'infiammazione, sia un ampio range di mediatori dell'infiammazione (citochine pro-infiammatorie e chemochine) in una coorte di soggetti affetti da differenti malattie autoinfiammatorie sia ereditarie quali FMF e TRAPS, sia complesse quali Behçet e morbo di Still nell'adulto. Lo scopo era approfondire le conoscenze molecolari di tali patologie per identificare possibili biomarcatori predittivi o diagnostici per ciascuna malattia e sviluppare in futuro strategie terapeutiche mirate e preventive. MATERIALI E METODI Per l'analisi funzionale in vitro sulla sindrome di Blau, punto di partenza è stato la produzione di 3 costrutti contenenti cDNA umano di NOD2 wild-type e mutato p.E383K e p.R334W. Questi costrutti sono stati trasfettati stabilmente in cellule HEK293, poste poi in coltura per 7 e 24 ore in presenza o assenza di muramildipeptide MDP [10μg/ml]. L’attività di NF-κB è stata determinata dapprima indirettamente valutando l’espressione di IKBα e forma fosforilata nelle cellule mutagenizzate p.E383K mediante Western blotting dei lisati cellulari. In seguito mediante Reverse Phase Protein Array (RPPA) è stata valutata l'espressione dei componenti del pathway rispetto a NOD2 wild-type. É stata inoltre dosata l'IL8 nei surnatanti delle colture mediante tecnica antibody microarray. Per l'analisi funzionale ex vivo relativa alla sindrome di Blau, sono stati analizzati 2 soggetti italiani affetti e portatori della mutazione p.E383K, da cui sono state estratte le cellule monocitarie del sangue periferico (PBMC). Per la valutazione dell'attività NF-κB, i PBMC sono stati lisati e analizzati mediante RPPA. Per la produzione di citochine (IL1β, IL6, IL8, TNFα, IFNγ, IL12, IL17, IL22, IL23) i PBMC sono stati invece posti in coltura per 7 ore in presenza o assenza di agenti di stimolo quali lipopolisaccaride LPS [100ng/ml] e di muramildipeptide MDP [10μg/ml] e le citochine sono state dosate mediante tecnica ELISA e antibody microarray. Nella seconda parte dello studio, sono stati presi in esame 40 pazienti affetti da malattie autoinfiammatorie (Behçet, Still nell'adulto, FMF, TRAPS e Blau in particolare) e 27 controlli sani, dai quali sono stati raccolti siero e PBMC. Quest'ultimi sono stati lisati e preparati per l'analisi RPPA dei maggiori componenti delle vie del segnale NF-κB, PI3K/Akt, MAPK, JAK/STAT/c-Src e inflammasoma (NALP1). Dal siero sono state dosate IL1β, IL6, IL8, TNFα, IFNγ, IL12, IL17, IL22, IL23 mediante antibody microarray. RISULTATI La microscopia confocale ha evidenziato una pronunciata presenza di p.E383K NOD2 nel citoplasma delle cellule HEK293 trasfettate, così come per NOD2 wild-type e mutato p.R334W. L'espressione di p.E383K NOD2, valutata mediante Western blotting, non presenta variazioni in seguito a stimolazione con MDP per 7 o 24 ore. Per quanto concerne l'analisi del pathway NF-κB, lo studio in vitro presenta una mancata attivazione nelle cellule HEK293 presentanti p.E383K NOD2, mentre il pathway risulta upregolato ex vivo rispetto ai controlli sani. In vitro infatti si nota un'inferiore espressione di IKBa fosforilato rispetto a IKBa in presenza o assenza di stimolazione MDP, sia nell'analisi indiretta con Western blotting sia mediante RPPA dei lisati totali delle HEK293 trasfettate con p.E383K NOD2. Non è stato rilevato poi alcun incremento di espressione per altri componenti del pathway, quali la forma fosforilata di NF-κB, IKKα/β, anche nell'estratto nucleare. Sia lo studio in vitro che quello ex vivo non hanno identificato un incremento significativo, sia a livello basale che in seguito a stimolazione, di secrezione della maggior parte delle citochine pro-infiammatorie analizzate. Il dosaggio di IL8 in vitro presenta bassi livelli citochinici nelle cellule esprimenti p.E383K NOD2. I risultati basali ex vivo da surnatante rispecchiano quanto osservato da siero per le medesime citochine analizzate. Inoltre si è notato un rilascio di IL17, IL22 e IL23 maggiore nei pazienti, unitamente ad un minor rilascio di IL12, rispetto ai controlli. La presenza di stimolo (LPS; MDP o entrambi) non ha portato a incrementi significativi dei livelli di IL1β, IL6, IL8, TNFα e IFNγ nei pazienti rispetto ai controlli. La ricerca di biomarcatori nei pazienti affetti da malattie autoinfiammatorie ha evidenziato una up-regolazione di molti componenti pro-infiammatori dei pathwy studiati, quando comparati a soggetti sani. Nella malattia di Behçet, le vie metaboliche NF-κB, PI3K/Akt, Erk1/2 MAPK sono risultate statisticamente up-regolate, mentre nei pazienti affetti da Still dell'adulto tutti i pathway analizzati risultano essere maggiormente attivati rispetto ai controlli. Nei pazienti TRAPS, presentano livelli aumentati molti dei componenti dei pathway NF-κB, PI3K/Akt, Erk1/2 e SAPK MAPK, e JAK/STAT, mentre per i pazienti FMF si nota l'attivazione del pathway legato all'inflammasoma e di quello Erk1/2 e SAPK MAPK. Nella sindome di Blau sono invece risultati upregolati componenti dei pathway NF-κB, PI3K/Akt e p38 MAPK. Dall'analisi citochinica nelle differenti malattie autoinfiammatorie si evince un maggior rilascio di IL18, IL22, IL23 e IL17 in tutte le patologie analizzate. Inoltre si è notato un incremento significativo dei livelli di TNFα e IFNγ nei pazienti TRAPS, di IL1β, IL6 e IFNγ nei pazienti FMF e di tutte le citochine in analisi nei pazienti affetti da Still dell'adulto. DISCUSSIONE Questa è la prima volta che viene studiata a livello funzionale la mutazione p.E383K nel gene CARD15/NOD2 associato alla sindrome di Blau. Per quanto riguarda il pathway NF-κB, i risultati contrastanti ottenuti in vitro ed ex vivo, possono indicare come l'attivazione non sia regolata solamente da NOD2 per i portatori della mutazione p.E383K. Ulteriori esperimenti saranno necessari per chiarire questi risultati, utilizzando anche differenti modelli cellulari in vitro. I risultati ex vivo e in vitro relativi al dosaggio citochinico non sembrano evidenziare un coinvolgimento primario di IL1β e delle altre citochine proinfiammatorie nella patogenesi della sindrome di Blau,ad eccezione di IL17/22/23, il cui ruolo dovrà essere studiato più approfonditamente. Questo lavoro di tesi offre inoltre una panoramica della patofisiologia molecolare di differenti malattie autoinfiammatorie. Un'analisi approfondita dei componenti dei pathway individuati con elevati livelli di espressione rispetto ai controlli sani sarà necessaria per identificare validi biomarcatori da poter utilizzare come target terapeutici. I profili citochinici ottenuti possono essere d'aiuto nel discriminare le differenti patologie sulla base di quali citochine presentino dosaggi maggiori rispetto ai controlli. Inoltre, IL17 IL22 e IL23 presentano livelli significativamente più elevati in tutte le malattie analizzate, suggerendo un importante ruolo nelle autoinfiammatorie per le cellule Th17 secernenti tali citochine. Utilizzare le cellule Th17 e le citochine ad esse associate come target terapeutico potrebbe essere in futuro un nuovo approccio nella cura delle malattie autoinfiammatorie