Effetti degli ormoni steroidei nell'omeostasi intracellulare del calcio e nella regolazione della crescita cellulare in cellule derivate da cervelletto di feto bovino

SOMMARIO Gli ormoni steroidei possono influenzare numerosi processi fisiologici attraverso meccanismi genomici e non genomici, sia in cellule eccitabili che in cellule non eccitabili. I neurosteroidi regolano numerosi processi cellulari (come la crescita e il differenziamento cellulare, e l’apoptosi) ed esercitano il loro effetto in svariati modi, ad esempio promuovendo o inibendo un particolare evento, a seconda della regione dell’encefalo in cui stanno agendo. In questo elaborato sono state approfondite due diverse tematiche: 1) lo studio dell’effetto genomico esercitato dall’estradiolo (E2) e dal testosterone (T) nella regolazione dell’omeostasi intracellulare dello ione calcio (Ca2+) in una linea cellulare non eccitabile; 2) la caratterizzazione dell’effetto trofico dell’E2 in cellule neuronali e nelle loro arborizzazioni dendritiche. Numerose evidenze sperimentali dimostrano che estrogeni ed androgeni regolano l’omeostasi intracellulare dello ione Ca2+. Gli effetti dei neurosterodi nelle cellule eccitabili sono ben noti; tuttavia, questi ormoni influenzano in maniera significativa anche la fisiologia di cellule non eccitabili, come i fibroblasti e le cellule dell’endotelio vascolare. Per questo primo argomento di studio ho utilizzato una linea cellulare stabilizzata derivata da cellule endoteliali isolate da cervelletto di feto bovino. Per caratterizzare gli effetti genomici prodotti da E2 (10nM) e T (10nM) sull’omeostasi intracellulare di Ca2+, le cellule sono state incubate con gli ormoni a diversi intervalli di tempo (8, 24, 48 ore). Quindi sono state usate sonde fluorescenti per il Ca2+ (Cameleon) indirizzate ai principali organelli intracellulari deputati al controllo dell’omeostasi di questo ione (citoplasma, reticolo endoplasmatico, mitocondri). I risultati dimostrano che il trattamento con T non produce alcun effetto. Nelle cellule incubate con E2, non sono state riscontrate variazioni né in citoplasma né in reticolo; al contrario, l’E2 incubato per 48 ore ha prodotto una diminuzione significativa nella quantità totale di Ca2+ misurata nei mitocondri. Questo effetto è stato annullato dall’aggiunta di ICI 182,780 (10nM), un antagonista non selettivo dei recettori degli estrogeni, suggerendo che l’azione dell’E2 è mediata dai propri recettori. In seguito sono state testate altre due concentrazioni di E2 (1nM e 100nM): anch’esse hanno causato una analoga diminuzione della quantità di Ca2+ nei mitocondri, suggerendo che la saturazione del recettore può avvenire già alla concentrazione 1nM. Per verificare se le alterazioni nei flussi di Ca2+ dovute all’E2 comportassero alterazioni nel potenziale di membrana mitocondriale (ΔΨm), le cellule sono state monitorate in presenza del tetra-methyl-rhodamine-methylester (TMRM) ma non è stata riscontrata alcuna differenza tra le cellule trattate e quelle di controllo. Infine, per verificare un possibile ruolo svolto dal poro di transizione di permeabilità (PTP), un canale della membrana interna mitocondriale, le cellule sono state trattate con ciclosporina-A (CsA) (0.8μM), uno specifico inibitore del PTP che si lega alla molecola chaperone di matrice ciclofilina-D. La CsA è stata in grado di invertire l’effetto dell’E2, riportando i valori dei trattati a quelli dei controlli e suggerendo che l’ormone possa svolgere un ruolo chiave nel processo di transizione di permeabilità mitocondriale (PTPM). Riassumendo, questi dati indicano che, in questa linea stabilizzata con caratteristiche endoteliali, l’effetto genomico prodotto dall’E2 può influenzare l’apertura del PTP senza causare una perdita del potenziale di membrana. Terminata questa prima fase del lavoro, mi sono dedicato allo studio dell’effetto trofico che l’E2 produce in cellule neuronali e nelle loro arborizzazioni dendritiche. I dendriti integrano e trasportano gli stimoli nervosi dalla periferia della cellula verso il soma ed è ampiamente riconosciuto che, nelle fasi precoci dello sviluppo embrionale, l’E2 modella la morfologia delle cellule neuronali attraverso una regolazione dello sviluppo delle arborizzazioni dendritiche. Gli estrogeni regolano la plasticità neuronale, la sinaptogenesi e la crescita cellulare in diverse regioni del SNC, come ad esempio la corteccia e l’ipotalamo. Pochi lavori hanno considerato gli effetti dell’E2 nella morfologia dei neuroni del cervelletto, una regione deputata al controllo dell’equilibrio, , della coordinazione motoria e di svariati altri processi cognitivi. Per questo tipo di analisi ho utilizzato colture cellulari primarie di neuroni derivate da cervelletto di feti di bovino di entrambi i sessi. Per mettere in evidenza le alterazioni morfologiche nei neuroni ho effettuato esperimenti di immunocitochimica in fluorescenza usando uno specifico anticorpo per neuroni immaturi, la βIII-tubulina, confrontando gli effetti dell’E2 (100nM) in cellule trattate rispetto a neuroni di controllo. Come parametri morfometrici ho scelto: area e perimetro del soma, numero, lunghezza e diametro dei prolungamenti dendritici. I risultati indicano che nelle cellule da femmina, l’E2 aumenta tutti i parametri misurati, mentre nei maschi l’effetto trofico è limitato solo ad alcuni valori. Inoltre, le femmine mostrano valori maggiori rispetto ai maschi nelle dimensioni del soma, nel numero e nella lunghezza dei prolungamenti. Al contrario nei maschi si osserva un valore superiore nel diametro dei prolungamenti. Questi dati preliminari suggeriscono che l’E2 (100nM) produce un effetto trofico sia nelle cellule di maschio che in quelle di femmina; inoltre è possibile ipotizzare che, in questo stadio dello sviluppo embrionale, i neuroni di cervelletto abbiamo caratteristiche dimorfiche.