Searching for molecular mechanisms sustaining tumor formation and progression in Neurofibromatosis type 1

SOMMARIO Neurofibromatosi tipo 1 (NF1, OMIM # 162200), nota anche come di von Recklinghausen, è una malattia autosomica dominante causata da mutazioni del gene NF1 che codifica una proteina coi 2818 aminoacidi , detta neurofibromina (Nf). Più di 900 diverse mutazioni nel gene NF1 sono state identificate (HGMD, Database di mutazione genetica umana). Mutazioni del gene NF1 causano una varietà di manifestazioni cliniche quali il glioma ottico, neoplasie del sistema ematopoietico e disabilità dell'apprendimento. Tuttavia, il segno distintivo della NF1 è lo sviluppo dei tumori benigni nella guaina dei nervi periferici, chiamati neurofibromi. I neurofibromi sono tumori complessi originati da guaine nervose periferiche e costituiti prevalentemente da cellule di Schwann omozigote mutate per NF1, mastociti e fibroblasti entrambi eterozigoti per la stessa mutazione. I plessiformi possono progredire a sarcomi altamente maligni denominati MPNSTs (schwannomi maligni), che sono quasi sempre letali. Ad oggi non e’ ancora stata sviluppata alcuna terapia efficace in grado di ridurre la dimensione e incidenza dei neurofibromi, o atta a contrastarne la formazione. La caratteristica principale dei neurofibromi è la loro struttura rigida conseguente alla massiccia deposizione di collagene prodotto dai fibroblasti attivati. Queste cellule, denominate miofibroblasti, sono fortemente stimolate da mastociti che producono fattore di crescita trascrizionale-Beta (TGF-Beta) per produrre poi fattori di crescita, come fattore di crescita piastrinico, fattore di crescita dei fibroblasti e collagene. Ciò comporta sia la potente proliferazione di cellule di Schwann che la deposizione di matrice extracellulare rigida. Cellule aploinsufficienti per Nf1 comportano iperattivazione di Ras, che aumenta ulteriormente con LOH. L'attivazione di vie di segnale di Ras/Raf/ERK in cellule di Schwann rende le cellule più suscettibili ai segnali proliferativi forniti dalla nicchia NF1+/-. Tuttavia, la risposta fisiologica a Ras iperattivato è l’arresto del ciclo cellulare e/o senescenza piuttosto che trasformazione. La trasformazione Ras-mediata di cellule di Schwann probabilmente si basa su un procedimento che integra diversi segnali dipendenti da circuiti di amplificazione della nicchia stessa. Uno dei più importanti componenti della nicchia è la matrice extracellulare (ECM), una rete complessa di macromolecole con plasticità variabile che contribuisce alla progressione tumorale. L’elasticità di ECM determina la modalità con cui una cellula percepisce le forze esterne e quindi fornisce un importante spunto ambientale che determina il comportamento cellulare. In effetti le adesioni focali, che consistono di integrine, adattatori multicomplesi e proteine di segnale, possono essere visti come meccano-sensori che collegano il citoscheletro con la ECM. Come la mancanza di Nf1 possa avere un impatto significativo sulla complessità di dinamismo di ECM-cellula o come la grande rigidezza dell'ECM in neurofibroma influenzi il comportamento delle cellule di Schwann, è ancora sconosciuto. Tra i tre domini funzionali descritti nella proteina, un dominio di legame, FAK, sulla proteina è stato identificato e Nf1 ha mostrato di interagire con FAK, spianando la strada per l'enunciazione di una nuova ipotesi per spiegare il percorso trasformazionale delle cellule di Schwann verso il cancro. Razionale: come in altri tumori {Lu, 2012 #289}, {Yu, 2011 #292}), anche nei neurofibromi plessiformi il fenotipo trasformato di SCs è favorito dall'amplificazione della segnalazione di percorsi integrati attivati sia da perdita di Nf1, Ras iperattivazione che deregolamentato di matrice extracellulare (ECM). Le modifiche delle proprietà meccaniche di ECM a causa dell'aumento di secrezione di collagene dai miofibroblasti potrebbe contribuire attivamente alla progressione del tumore, influenzando profili di espressione genica delle cellule attraverso la valorizzazione di segnale di Ras pathway generato dall'adesione focale (FAK). L'indagine in profondità di queste modificazioni biologiche attivate in SCs dalla formazione di ECM è l'obiettivo del presente progetto. Al fine di far luce su questo argomento, abbiamo intenzione di 1) generare un nuovo modello sperimentale tridimensionale in vitro che riproduce la complessità di neurofibroma pluricellulari con le cellule primarie. Cellule immortalizzate, infatti, non sono adatte per i nostri scopi poiché gli oncologi molecolari consideranno il processo di immortalizzazione come il primo colpo che conduce al fenotipo oncogenico, a causa dei cambiamenti che sono stati fatti per il controllo del ciclo cellulare di espressione genica; 2) valutare l'esigenza di ECM nella trasformazione di cellule di Schwann cell (SCs) in questo nuovo sistema in vitro identificando la corretta composizione dell'ECM e rigidità in matrigel (strutturali e non strutturali) per formazione di neurofibroma. Risultati: Isolamento delle cellule di Schwann e Fibroblasti primarie da Neurofibromi e la loro caratterizzazione biologica: 1) Abbiamo già isolato e coltivato in 2D le nostre cellule di Schwann e Fibroblasti NF1+/- secondo la metodologia di Serra {Serra, 2000 #210}. Queste cellule sono state isolate da biopsie di neurofibromi plessiformi dopo aver consenso informato dei pazienti mediante i nostri collaboratori presso Università di Milano e di Roma. Per ottenere due popolazioni delle cellule di Schwann e Fibroblasti abbiamo coltivato le cellule in terreno selettivo (secondo {Serra, 2000 #210}, e il nostro nuovo protocollo inedito) e caratterizzato dal punto di vista biochimico: S100B {Tucker, 2011 #321} e p75 marcatori che riconoscono specificamente le cellule di Schwann e secrezione del collagene di tipo I, espressione dell’actìna alfa del muscolo liscio (α-SMA), attivazione di Smad2/3, attivazione di abl chinasi e caratterizzare l'attività di myo-fibroblasti {Kojima, 2010 #150}. 2) abbiamo già ottenuto le colonie di cellule di Schwann cresciute nel sistema 3D in vitro come descritto nella fase 1 e 2 (in transwell-like chamber per permettere la stimolazione autocrina tra myofibroblasti e le cellule di Schwann). I nostri dati preliminari mostrano che le cellule primarie di Schwann generano delle colonie solo quando piastrate in una ECM/ membrana basale ricostituita del collagene di tipo I di Matrigel di almeno 3 mg/ml. Tuttavia, dobbiamo ancora impostare le condizioni migliori di cultura per mantenere le cellule altamente proliferanti. Indicazioni preliminari in fibroblasti Embrionali immortalati Murini (MEFs) In altri modelli cellulari come nel fibroblasti NF1-/- murini (MEFs), abbiamo trovato che l'assenza di neurofibromina scorrela con la deregolata di fosforilazione del FAK in Y397 e Y925 sia in assenza di raggruppamento di integrine che dopo la stimolazione con ligando. Inoltre, il saggio di tumorigenesi mostrava che la capacità di cellule di MEFNf1-/- di formare colonie è influenzata sia da inibitore di MECK che inibitore FAK Y15 indicante il ruolo di cooperatzione di FAK e PDGFBB, fattore di crescita, nel processo di tumorigenesi mediato da NF1. Coerentemente, gli esperimenti di immunoprecipitazione hanno mostrato che in cellule null NF1, il recettore del fattore di crescita di proteina legata2 (Grb-2), l’iniziatore di via di segnale di RAS, interagisce con FAK anche in assenza di collagene in un modo PDGFBB ligando-dipendente, suggerendo così che FAK e recettori di fattori di crescita possono cooperare per aumentare l'attività di Ras con un valore di soglia necessario per indurre la tumorigenesi.