Are the heterogeneous nuclear ribonucleoproteins SQUID and Hrb87F involved in the regulation of circadian rhythmicity in Drosophila melanogaster?

La ricerca di nuovi geni coinvolti nel controllo della ritmicità circadiana in Drosophila melanogaster ha permesso di identificare una possibile interazione delle due ribonucleoproteine SQUID e HRB87F con CRYPTOCROME. Nella regolazione molecolare dell’orologio circadiano, si sono evoluti diversi eventi di regolazione post trascrizionale che aggiustano e consolidano l’espressione ritmica dei geni orologio e delle corrispettive proteine, secondo un meccanismo a feedback negativo. Per tale motivo lo scopo di questo lavoro è stato studiare e analizzare il possibile coinvolgimento delle hnRNPs nel controllo post-trascrizionale dell’orologio circadiano in Drosophila. In una fase iniziale, per confermare i risultati ottenuti in precedenza, sono stati condotti esperimenti di Co-Immunoprecipitazione e western-blot in mosche transgeniche in grado di esprimere una versione di CRY associata all’epitopo HA (HACRY) sotto il controllo del driver timGal4. L’anticorpo anti-SQUID ha identificato una proteina nel campione co-immunoprecipitato, confermando l’interazione, mentre il legame con HRB87F è stato osservato mediante l’utilizzo del sistema del doppio ibrido di lievito. In seguito è stato valutato il possibile coinvolgimento dell’orologio circadiano nell’espressione delle hnRNPs nell’intera testa del moscerino. I livelli di espressione del mRNA di Hrb87F mostrano un trend oscillatorio in LD (luce-buio) e DD (buio costante), sia nel wt che nel mutante per0, mentre la proteina oscilla in LD e DD nelle mosche wt, ma non nelle per0, suggerendo un possibile ruolo dell’orologio circadiano nel controllo traduzionale o post-traduzionale della proteina. L’analisi dell’espressione del gene Squid ha dimostrato, invece, che né mRNA né proteina vengono espressi in maniera ritmica, né in LD né DD. Successivamente, è stato studiato l’intervento delle due ribonucleoproteine nella generazione della ritmicità circadiana, analizzando l’attività locomotoria di mosche mutanti per entrambi i geni. Tutti i mutanti hanno riportato un’alterazione della ritmicità circadiana, con una perdita dell’anticipazione dell’attività mattutina in LD e bassi livelli di ritmicità in DD a 29°C, 23°C, 18°C e 15°C. I risultati ottenuti suggeriscono che Squid e Hrb87F possano partecipare alla generazione di un fenotipo ritmico nell’attività locomotoria. Questa analisi è stata completata studiando, inoltre, l’attività locomotoria del mutante squid in condizione di luce costante (LL), poiché esibiva un fenotipo associabile a quello in cui è presente un’alterazione del meccanismo di sincronizzazione della luce; si è visto che, le mosche mutanti presentano un risposta in LL paragonabile al wt, sottolineando un corretto funzionamento del meccanismo di sincronizzazione della luce. Abbiamo analizzato i profili di espressione dei geni period e timeless e delle rispettive varianti dovute a splicing alternativo legato alla temperatura. I risultati ottenuti mostrano che l’espressione è alterata nel mutante Squid, rispetto al controllo wt, sia in LD sia in DD ad ogni temperatura considerata, evidenziando che è presente un elevata attività di splicing. In fine, in collaborazione con la Dott. Milena Damulewicz (Università di Jagiellonian di Kracovia - Polonia), è stata condotta un’analisi dell’espressione di PERIOD nei neuroni orologio in mosche mutanti Squid e wt, mediante immunocitochimica a 18°C e 23°C in LD e DD. Si è visto che sia a 23°C sia a 18°C, l’oscillazione di PER nei neuroni orologio l-LNv, viene persa sia in LD sia in DD, mentre nei neuroni s-LNv sia a 23°C sia a 18°C si assiste a un ritardo nell’accumulo della proteina seguito da una cinetica di degradazione più lenta rispetto ai controlli. L’analisi delle proiezioni del neuropeptide PDF ha evidenziato una profonda disorganizzate nel mutante squid. Nel complesso, tutti questi risultati suggeriscono un coinvolgimento di HRB87F e SQUID nella generazione e nel mantenimento della ritmicità circadiana in Drosophila melanogaster.