An epigenetic approach to study gene regulation in two different grapevine rootstocks: from histone modifications to gene expression

Riassunto Durante il diciannovesimo secolo la viticoltura europea fu devastata dall’introduzione di un insetto fitofago di origine nord americana la Daktuloshaira vitifoliae nota comunemente con il nome di “Phylloxera della vite”. Da quel momento iniziò una nuova era per la viticoltura con l’utilizzo dell’innesto di varietà di V. vinifera in portinnesti provenienti dalle zone di origine del parassita. L’introduzione di sistemi radicali di specie americane e non vinifera si focalizzò inizialmente sugli aspetti della protezione della viticoltura dall’attacco del parassita. Molto presto, tuttavia, si capì che l’utilizzo del portinnesto non solo conferiva resistenza alla malattia ma implicava anche una serie di vantaggi influenzando numerosi processi fisiologici a livello del nesto, come ad esempio la resistenza agli stress abiotici. Alla luce dei cambiamenti climatici che stanno coinvolgendo il nostro pianeta, la viticoltura, così come l’intera agricoltura, necessita di sviluppare piante in grado di gestire situazioni di siccità prolungata. Il gruppo di ricerca del DiSAA dell’Università di Milano dal 1985 è coinvolto nello studio nuovi genotipi di vite con l’obbiettivo di ottenere nuovi ibridi utilizzabili come portinnesti e maggiormente performanti in situazioni di stress abiotico. In uno screening preliminare, uno di questi, denominato M4 [(V. vinifera x V. berlandieri) x V. berlandieri x cv Resseguier n.1], fu selezionato per la resistenza elevata allo stress idrico e salino. All’interno del progetto Ager-Serres 2010-2105 sono stati eseguiti degli studi biochimici e fisiologici comparando il genotipo sperimentale M4 con un portinnesto commerciale suscettibile allo stress idrico, 101.14 (V. riparia x V. rupestris). Questi dati sono stati integrati ad approcci di Next Generation Sequencing (NGS) volti a studiare i genomi ed i profili trascrizionali dei due portinnesti cresciuti in condizioni di stress idrico e di controllo. L’obiettivo principale del progetto Ager-Serres, risiede nell’identificazione di geni marcatori che possano essere utilizzati per la selezione di nuovi portinnesti con maggiori performance in situazioni di stress idrico. Questo progetto di dottorato si inserisce all’interno del progetto Ager-Serres ed è volto a studiare la relazione tra profili trascrizionali e modifiche istoniche nei portinnesti 101.14 e M4. Dati di letteratura relativi ad altre specie hanno dimostrato infatti che il rimodellamento della cromatina, le modifiche istoniche ed i processi correlati alla cromatina, agiscono in maniera dinamica sulla struttura della cromatina stessa per la regolazione dell’espressione genica. I nucleosomi sono le unità fondamentali della cromatina che può essere definita come una struttura altamente condensata che costituisce la base per processi nucleari fondamentali come trascrizione, replicazione e riparazione del DNA. Oggigiorno è chiaro appunto che la funzione della cromatina non si esaurisce nell’impacchettamento del DNA e nella sua protezione ma risiede anche nel controllo dell’espressione genica. Gli organismi hanno infatti evoluto dei meccanismi atti a alterare la struttura della cromatina consentendo l’accesso o l’esclusione di complessi trascrizionali. Per condurre questa ricerca, un gruppo di piante di ciascun genotipo (101.14 e M4) è stato fatto crescere in vitro. Il materiale fogliare è stato campionato e l’espressione genica studiata attraverso un mRNA-Sequencing (mRNA-seq). La distribuzione di modifiche istoniche, come l’acetilazione della lisina 9 dell’istone H3 (H3K9ac) e la trimetilazione della lisina 4 dello stesso istone (H3K4me3), sono state valutate attraverso un approccio di ChIP-Sequencing (ChIP-seq). Questa ricerca rappresenta il primo studio di questo tipo condotto nel genere Vitis. Oggigiorno i sequenziamenti di mRNA sono divenuti analisi di routine per la valutazione dei profili trascrizionali in un gran numero di specie vegetali mentre l’utilizzo di approcci di ChIP-seq rimane limitato alle piante modello. Durante questo progetto di dottorato molto lavoro è stato investito nello sviluppo di un protocollo di immunoprecipitazione che fosse performante per l’estrazione ed il sequenziamento della cromatina di materiale fogliare di piante di vite. Dati di letteratura riguardanti altre specie vegetali hanno individuato una correlazione positiva tra le modifiche istoniche H3K9ac ed H3K4me3 e l’espressione genica. Si è inoltre stabilito che questi marchi giacciono preferenzialmente nella regione del sito di inizio della trascrizione (TSS) dei geni ma l’identificazione di questi siti è ancora mancante nell’annotazione del genoma di vite. Per questo motivo si è deciso di effettuare analisi di arricchimento sulla cromatina immunoprecipitata scegliendo in maniera arbitraria un intervallo di 1000 paia di basi a monte del codone d’inizio (ATG) dei geni e considerando, per ogni gene, il numero di reads che allineano in questo intervallo. Le reads mappanti nella regione considerata sono state normalizzate ed i geni studiati in termini di arricchimento o deplezione della modifica rispetto alla cromatina non immunoprecipitata. I gruppi di geni arricchiti in un genotipo e depleti nell’altro, sono stati posti in relazione con i profili trascrizionali individuando così una correlazione positiva tra la modifica istonica H3K9ac e l’espressione genica. Questo andamento non è stato riscontrato analizzando la trimetilazione della lisina 4 dell’istone H3. Considerando, tuttavia, i geni che presentano un arricchimento in un genotipo e una deplezione nell’altro, contemporaneamente per entrambi i marchi istonici, è stata identificata una correlazione positiva con i profili trascrizionali. I risultati di questo studio sono le prime evidenze di una correlazione positiva tra modifiche istoniche H3K9ac e H3K4me3, quando presente contemporaneamente ad H3K9ac ed espressione genica in vite.