Sintesi e caratterizzazione di sensori chimici fluorescenti per l'imaging di Ca2+ in sistemi viventi

Calcium (Ca2+) signaling triggers essential biological processes. The high versatility of Ca2+ as an intracellular messenger relies on the possibility of finely tuning both the amplitude and time course of Ca2+ waves, which contribute to the specification of downstream effects. Starting from the ‘80s, many efforts have been devoted to the generation of tools to measure intracellular Ca2+ concentration ([Ca2+]). In recent years, the attention of researchers moved to Ca2+ dynamics inside subcellular compartments, and the need for organelle-targeted indicators has become critical. Indeed, by taking up and releasing Ca2+, intracellular organelles are fundamental players in shaping cytosolic Ca2+ signals. Several organelle-targeted genetically-encoded Ca2+ indicators (GECIs) have been developed so far. However, they suffer from different drawbacks, e.g., the need of transfection procedures to be delivered and the Ca2+-affinity not readily controllable. Chemical Ca2+ indicators (CCIs) represent a valid alternative to GECIs. They are typically based on an organic fluorophore covalently linked to the Ca2+ chelating domain 1,2-bis(o-aminophenoxy)ethane-N,N,N’,N’-tetraacetic acid (BAPTA), with high selectivity for Ca2+ over Mg2+. Acetoxymethyl (AM) esters groups are used to bio-reversibly protect the carboxylic moieties since the free acid form of BAPTA is unable to cross cell membranes. Despite the invaluable impact of CCIs, their organelle-targeting has so far been poorly exploited. The project goal was to develop new CCIs to monitor in vivo real-time [Ca2+] in specific subcellular compartments. To this end, fluorescent ratiometric dyes with suitably tuned Ca2+-affinity have been combined with molecular features that confer specific subcellular localization. Three primary components constitute the resulting probes: i) a BAPTA-based fluorescent CCI; ii) a specific organelle-targeting moiety; iii) a spacer that covalently joins the two. Three new mitochondriotropic Ca2+ probes have been developed by exploiting the targeting ability of triphenylphosphonium lipophilic cations. They all demonstrated capabilities to permeate plasma membrane (PM), to selectively accumulate within mitochondria, and to respond consistently to [Ca2+] variations in the mitochondrial matrix, also in cell systems where the delivery of GECIs is troublesome. This represents a major breakthrough in the field of Ca2+ imaging techniques, as the synthesized probes represent the first mitochondria-targeted ratiometric CCIs ever developed. To deliver CCIs to the ER lumen, conjugation with cyclohexyl sulfonylurea or toluene sulfonamide has been exploited. Despite the targeting approach proved successful to target the two synthesized precursors to the ER, their AM-protected form was unable to cross the PM. A 3rd probe was therefore synthesized to overcome the diffusion problem. Furthermore, three new red-shifted ratiometric fluorescent CCIs with different Ca2+-affinities have been developed to avoid toxicity due to UV excitation. Interestingly, these dyes showed selective accumulation in lysosomes, where acidic lumenal pH values hamper the accurate determination of [Ca2+] with CCIs, due to protonation of their carboxyl functionalities that influence their Ca2+-affinities. Finally, a NLS (Nuclear Localization Sequence) peptide-based conjugation approach has been explored as proof-of-principle for Ca2+-sensors delivery inside the nucleus of living cells. Unfortunately, they do not demonstrate adequate PM permeability. The availability of reliable tools to directly measure [Ca2+] in intracellular organelles is critically important for a comprehensive understanding of biological mechanisms. In addition, this doctoral project has laid the groundwork for the development of new probes for the measurement, in principle, of any analyte in precise subcellular compartments.

I segnali di calcio (Ca2+) regolano molti processi biologici. L’alta versatilità del Ca2+ come messaggero intracellulare si basa sulla capacità che ha la cellula di controllare accuratamente l’ampiezza e la durata delle fluttuazioni della sua concentrazione. Molti sforzi sono stati profusi per lo sviluppo di strumenti per la misurazione della concentrazione intracellulare di Ca2+ ([Ca2+]). Recentemente, l’attenzione dei ricercatori si è focalizzata sulla comprensione delle dinamiche del Ca2+ all’interno dei singoli compartimenti subcellulari, e di conseguenza si è reso necessario lo sviluppo di sensori organello-specifici. Infatti, gli organelli, internalizzando e rilasciando Ca2+, rivestono un ruolo chiave nella modulazione della [Ca2+] citosolica. Diversi indicatori per il Ca2+ geneticamente codificati (GECIs) per l’espressione in specifici organelli sono stati sviluppati. Questa tipologia di indicatori, tuttavia, soffre di diversi svantaggi: ad esempio risultano necessarie complesse procedure di trasfezione per il loro utilizzo, rendendoli non applicabili a tutte le tipologie cellulari. Gli indicatori chimici per il Ca2+ (CCIs) rappresentano una valida alternativa ai GECIs. I CCIs sono tipicamente basati su un fluoroforo organico covalentemente legato al dominio chelante del Ca2+ del BAPTA. Il gruppo acetossimetil (AM) estere viene usato per proteggere bio-reversibilmente le funzionalità carbossiliche poiché la forma acida del BAPTA non è in grado di permeare le membrane cellulari. L’obiettivo di questo progetto è lo sviluppo e la caratterizzazione di nuovi CCIs capaci di monitorare in vivo in tempo reale la [Ca2+] in specifici compartimenti cellulari. Tale scopo può essere conseguito con lo sviluppo di nuovi sensori basati su indicatori raziometrici fluorescenti con un’affinità per il Ca2+ adeguatamente modulata, funzionalizzati con domini molecolari che ne conferiscano una specifica localizzazione subcellulare. Tre nuovi sensori mitocondriotropici per il Ca2+ sono stati sviluppati sfruttando l’abilità di targeting dei cationi lipofilici di trifenilfosfonio. Tali sensori hanno dimostrato la loro capacità nel permeare la membrana plasmatica e accumulare selettivamente nei mitocondri e di rispondere in modo coerente alle variazioni di [Ca2+] nella matrice mitocondriale, anche in sistemi cellulari dove l’utilizzo dei GECIs è problematico. Per veicolare i CCIs nel lume dell’ER è stata sfruttata la coniugazione con cicloesil sulfonil urea o toluen sulfonammide. Nonostante l’approccio di targeting ha dimostrato di veicolare i due precursori sintetizzati nell’ER, la forma AM estere non è stata in grado di attraversare la membrana plasmatica. Un terzo sensore è stato quindi sintetizzato per superare i problemi di diffusione. Sono stati inoltre sviluppati tre CCIs fluorescenti e raziometrici, aventi diverse affinità per il Ca2+ e capaci di emettere fluorescenza nella porzione rossa dello spettro elettromagnetico per evitare l’eccitazione dei sensori con radiazione UV. Questi nuovi indicatori hanno inoltre mostrato un interessante accumulo selettivo nei lisosomi, dove il pH acido ostacola l’accurata determinazione della [Ca2+]. Infine, un approccio basato sulla coniugazione del peptide NLS (Nuclear Localization Sequence) è stato sperimentato come proof-of-principle di CCIs veicolati al nucleo di cellule viventi. Questi sensori non hanno tuttavia dimostrato un’adeguata permeabilità alla membrana plasmatica. La disponibilità di strumenti affidabili per misurare direttamente la [Ca2+] negli organelli cellulari è fondamentale per una comprensione completa dei meccanismi biologici. Oltre a fornire nuovi strumenti per questo importante obiettivo, questo progetto di dottorato ha posto le basi per lo sviluppo di nuove sonde per la misurazione, in principio, di qualsiasi analita in precisi compartimenti subcellulari.