Studying autophagy-related genes in zebrafish, a crispr/cas9-based approach

L’autofagia è un processo catabolico evolutivamente conservato in cui la cellula degrada e ricicla, mediante i lisosomi, proteine e organelli non più funzionanti, per mantenere l’omeostasi cellulare. Questo processo svolge un ruolo chiave durante lo sviluppo, la normale fisiologia della cellula e la sopravvivenza in mancanza di nutrienti, ma anche in diverse patologie umane come malattie infiammatorie e neurodegenerative, distrofie congenite, e sviluppo tumorale. L’autofagia si compone di una cascata di passaggi finemente regolati che coinvolgono un insieme specifico di proteine. Due di queste, Ambra1 ed Epg5, sono state l’oggetto della mia tesi di dottorato. La proteina Ambra1 è un regolatore positivo dell’autofagia Beclin 1 (BECN1) dipendente, ma è anche coinvolta in processi quali apoptosi, proliferazione cellulare e sviluppo, grazie alla sua capacità di legare altre proteine regolatrici. Epg5 (Ectopic P-granule protein 5) è invece necessaria nella fase finale del processo autofagico per la fusione degli autofagosomi con gli endosomi tardivi e i lisosomi. Nell’uomo, mutazioni recessive di questo gene sono state associate a un raro disturbo multisistemico, la sindrome di Vici, principalmente caratterizzata da agenesi del corpo calloso, ipopigmentazione oculocutanea, immunodeficienza variabile, cardiomiopatie e miopatie del muscolo scheletrico, e ridotta attività autofagica. In questa tesi descrivo la generazione, validazione e caratterizzazione di tre linee mutanti di zebrafish ottenute mediante la tecnica di mutagenesi mirata CRISPR/Cas9, per studiare le funzioni delle proteine autofagiche Epg5, Ambra1a e Ambra1b. Inoltre, sempre nello zebrafish, ho anche validato la specificità degli oligo morfolino per i geni paraloghi ambra1a e ambra1b, utilizzando la linea mutante ambra1a-/-. Ho inoltre analizzato il coinvolgimento di questi geni paraloghi nello sviluppo del cuore. Nel primo capitolo è descritta la preparazione e caratterizzazione delle linee mutanti per epg5, generate per ottenere un modello di studio per la sindrome di Vici o per altre malattie correlate all’autofagia. Nello zebrafish i trascritti di epg5 sono presenti come eredità materna nei primi stadi dello sviluppo, suggerendo un loro possibile ruolo nello sviluppo dello zebrafish. Sono state generate due linee mutanti, con delezioni rispettivamente di 13 e di 20 nucleotidi nel primo esone codificante, che portano, in entrambi i casi, alla formazione di codoni di stop prematuri. Una completa caratterizzazione della linea è stata condotta solo su quella che presenta la delezione più lunga. Nei mutanti è stato confermato il blocco del processo autofagico, sia in condizioni basali che di digiuno, grazie ad esperimenti di western blotting e analisi sia di birifrangenza che ultrastrutturali del muscolo delle larve. Tutti gli approcci sperimentali hanno mostrato come i mutanti epg5-/- presentino un marcato accumulo di autofagosomi non degradati e una riduzione delle fibre muscolari in seguito al digiuno. Un possibile ritardo nello sviluppo dell’intestino è stato messo in evidenza dall’analisi delle cellule mucipare caliciformi e da una riduzione nel tasso di crescita osservato negli stadi larvali della linea mutante. Nonostante questo, i mutanti epg5-/- si sviluppano normalmente e raggiungono la maturità sessuale privi di un fenotipo evidente. Tuttavia, dopo 8-10 mesi i mutanti presentano una riduzione della fertilità, confermata dalla presenza di soli ovociti primari nell’ovario e di alterazioni nella morfologia dei testicoli, una diminuita motilità e una riduzione delle dimensioni dei muscoli nel tronco. In accordo con la sindrome di Vici, gli adulti presentano inoltre una dilatazione del cuore e riduzione dello spessore del miocardio compatto. Per analizzare il flusso autofagico, sono state generate delle linee epg5-/- in background transgenico per lc3, rab7, rab5 e lamp1. Gli spot fluorescenti Lc3-II (che evidenziano gli autofagosomi), Lamp1 (che evidenziano i lisosomi maturi), come anche quelli Rab7 (negli endosomi tardivi e lisosomi) si accumulano nelle larve epg5-/-, confermando come il silenziamento di Epg5 porti ad un blocco del flusso autofagico. Il secondo capitolo descrive la generazione di linee zebrafish mutanti per i geni paraloghi ambra1a e ambra1b. A differenza dei risultati ottenuti con i corrispondenti ATGmorpholino, gli embrioni mutanti ambra1a-/- e ambra1b-/- non mostrano difetti evidenti durante lo sviluppo. Un aumento della trascrizione del gene ambra1b nei mutanti ambra1a-/- suggerisce un possibile effetto compensatorio tra i due geni paraloghi. Inoltre, i mutanti ambra1a-/- non presentano alterazioni del fenotipo quando iniettati con ambra1a-MO, mentre evidenziano un fenotipo abbastanza severo dopo knockdown con ambra1b-MO. La completa assenza di femmine adulte nella linea mutante ambra1b-/- suggerisce che Ambra1b possa avere un ruolo critico nella determinazione sessuale e/o nello sviluppo e differenziamento dell’ovario. Inoltre, nonostante i mutanti ambra1a-/- e ambra1b-/- siano singolarmente vitali, non è stato possibile ottenere la linea doppia mutante, poiché i pesci con entrambe le mutazioni non sopravvivono oltre lo stadio larvale. Il terzo capitolo descrive l’analisi degli effetti del knockdown con i morfolini ambra1aATG e ambra1b-ATG sullo sviluppo cardiaco. Lavori precedenti avevano infatti mostrato il coinvolgimento di queste proteine nello sviluppo del cuore. Entrambi i trascritti di ambra1 sono presenti nella regione del cuore di embrioni a due giorni dalla fecondazione. Il silenziamento delle due proteine mediante ATG-morfolino modifica in modo evidente lo sviluppo del cuore che risulta più piccolo, di forma allungata e con edema pericardico. La microiniezione di morfolino che agisce sul processo di splicing (SPLIC-MO) non determina alcun fenotipo cardiaco, indicando come in questo processo siano fondamentali i messaggeri materni. Le analisi condotte hanno anche messo in evidenza come il silenziamento di entrambe le forme di ambra1 interferisca con la lateralizzazione del cuore. Il fenotipo cardiaco dei morfanti viene recuperato con successo mediante co-iniezione con il messaggero AMBRA1 umano, risultato che sottolinea la conservazione delle funzioni di questa proteina durante l'evoluzione. Infine, essendo stato suggerito in topi e ratti un ruolo per la defosforilazione mediata da PP2A (Protein Phosphatase 2) nella morfogenesi cardiaca e sapendo che questa proteina interagisce con AMBRA1 per controllare la proliferazione cellulare, sono stati condotti esperimenti di recupero del fenotipo con il messaggero umano di AMBRA1 mutato nel sito di legame per PP2A (hAMBRA1PXP). È interessante notare come questo messaggero non sia in grado di recuperare il fenotipo cardiaco allo stesso modo della co-iniezione con mRNA non mutato suggerendo quindi che il ruolo rivestito dalle proteine Ambra1 nello sviluppo del cuore, sia, almeno in parte, legato all'interazione con la proteina fosfatasi PP2A.