Interleuchina-32 ed immunità innata: studio di modelli di flogosi in vitro in cellule epiteliali alveolari e monociti-macrofagi

Introduzione L’Interleuchina 32 (IL32) è una citochina proinfiammatoria di recente identificazione prodotta dai linfociti T, dalle cellule natural killer (NK), dai monociti e dalle cellule epiteliali. Essa svolge un ruolo chiave nella regolazione della risposta immunitaria ed è espressa in maniera significativa in alcune patologie infiammatorie croniche e a componente autoimmune. In questo studio, abbiamo identificato nella Broncopneumopatia Cronica Ostruttiva (BPCO) un possibile modello per indagare il ruolo di IL32 nell’infiammazione. Infatti, è stato dimostrato che la sua espressione è elevata nei macrofagi alveolari e nell’epitelio polmonare di soggetti fumatori affetti da BPCO rispetto a quelli non fumatori. La BPCO è una malattia caratterizzata dall’ostruzione irreversibile delle piccole vie aeree e da uno stato di infiammazione cronica del tessuto polmonare dovuto all’azione di vari fattori eziologici tra cui il fumo di sigaretta. Le cellule epiteliali alveolari e i macrofagi alveolari sono primariamente implicati nella patogenesi della BPCO, poiché, in risposta al danno, secernono fattori reclutanti le cellule del sistema immunitario che, in seguito, sostengono la flogosi portando, come conseguenza ultima, alla distruzione e al rimodellamento del parenchima polmonare. Scopo della Tesi Lo scopo di questo studio è stato quello di indagare il ruolo di IL32 nei meccanismi di risposta al danno polmonare e nell’innesco della risposta infiammatoria causati dal fumo. Inizialmente, abbiamo valutato se l’estratto di fumo (CSE) era un fattore citotossico per le cellule epiteliali e per i macrofagi e se induceva la loro apoptosi; inoltre, abbiamo indagato se il fumo contribuiva all’attivazione delle cellule modulando l’espressione, da parte di esse, di citochine e di fattori di crescita proinfiammatori. In seguito, abbiamo studiato se il CSE induceva la produzione di IL32 da parte di queste cellule e se esisteva un effetto sinergico tra la loro azione e quella di altri stimoli proinfiammatori nella modulazione dell’espressione di questa citochina. Materiali e metodi Per gli esperimenti abbiamo utilizzato le cellule epiteliali alveolari di tipo II, A549 e i macrofagi ottenuti dal differenziamento della linea monocitica THP1. Le cellule sono state trattate con il CSE, con i PAMPs e con l’IL1β. I PAMPs utilizzati sono: il polyI:C, l’imiquimod, l’MDP e l’ieDAP. La vitalità cellulare è stata valutata mediante test citofluorimetrico con Annessina V; l'espressione genica di CCL2/MCP1, RAGE, TNF-α e di IL32 è stata effettuata mediante Real Time-PCR. L’espressione proteica di IL32 è stata studiata mediante Western Blotting, mentre la presenza della proteina secreta è stata valutata nel sovranatante delle colture cellulari per mezzo del test ELISA. Risultati: Abbiamo dimostrato che il CSE a basse dosi (5%) era in grado di indurre l’apoptosi delle A549. Oltre a ciò, esso contribuiva alla loro attivazione inducendo un aumento dell’espressione di CCL2/MCP1 e di RAGE e, soprattutto, era in grado di aumentare i livelli di espressione genica di IL32, in particolare, quelli dell’isoforma β. Al fine di testare se il CSE rendeva le A549 più sensibili all’azione di altri fattori proinfiammatori, abbiamo co-trattato le cellule con CSE, con i PAMPs o con IL1β. Abbiamo osservato che le cellule trattate con CSE e IL1β avevano livelli di espressione di IL32β più alti rispetto a quelle trattate con gli stimoli da soli. Dall’altra parte, gli esperimenti condotti sui macrofagi hanno evidenziato che essi erano più resistenti all’apoptosi indotta da CSE, infatti, morivano solo ad alte concentrazioni (20%). Inoltre, il trattamento con CSE induceva un significativo aumento dell’espressione di TNF-α. Oltre a ciò, basse dosi di CSE aumentavano significativamente i livelli di espressione di IL32 e questo effetto risultava amplificato dal co-trattamento con CSE e IL1β. Discussione I dati ottenuti suggeriscono che il fumo rappresenta un importante fattore di citotossicità per l’epitelio il quale sembra avere un ruolo cruciale nelle fasi iniziali di risposta al danno. L’attivazione delle cellule alveolari porta alla produzione di mediatori dell’infiammazione che hanno il compito di reclutare i macrofagi i quali innescano la risposta immunitaria. IL32, sembra essere pesantemente coinvolta nei processi descritti poiché viene prodotta sia dalle cellule epiteliali che dai macrofagi e il contesto infiammatorio contribuisce ad amplificarne l’espressione