Correlation between the presence of the nuclear AR-V7 androgen receptor and clinical evolution of prostate cancer: in vitro analysis of a combination of compounds targeting PI3K

Introduzione: PCa è una malattia multiforme e biologicamente molto eterogenea. Diversi meccanismi chiave nella progressione della malattia da androgeno-dipendente ad androgeno-indipendente (CRCP) possono essere attribuiti ad alterazione nella via di segnalazione di AR. Scopo: Il disegno del nostro progetto è di valutare in vitro gli effetti di diversi composti che hanno come target mutazioni diverse coinvolte nello sviluppo e nella progressione del tumore della prostata e confrontare questi risultati con l’esperienza clinica di risposta alla terapia di pazienti con PCa con diversa progressione ed espressione di AR-V7 nel nucleo. Materiali e Metodi: Docetaxel, appartiene al gruppo dei taxani. L’abiraterone, inibitore del CYP17A1, ha come bersaglio l’attività sia della 17α-idrossilasi che della 17,20-liasi. L’enzalutamide, inibitore non steroideo di seconda generazione che legandosi al AR con maggiore affinità, riduce l'efficienza della traslocazione nucleare di AR e compromette sia il legame del DNA agli elementi di risposta degli androgeni che il reclutamento di coattivatori. La linea cellulare LnCaP deriva da un linfonodo di un paziente con cancro della prostata metastatico, mantiene la sensibilità agli androgeni. Esprime PSA (prostate specific antigen) e PSMA (Prostate specific membrane antigen), mantiene p53 wt e presenta PTEN (phosphatase and tensin homolog) mutato che porta all’attivazione costitutiva della via di AKT. VCaP sono cellule che derivano da metastasi vertebrali isolate da una vertebra lombare di un paziente refrattario alla terapia ormonale. Queste cellule esprimono PSA e PAP (prostatic acid phosphatase). VCaP esprimono AR wt ma presentano un’amplificazione di AR risultando in livelli più elevati di AR-FL, inoltre presentano la variazione di splicing 7, AR-V7. Esprimono PTEN ed il gene di fusione TMPRSS2-ERGPTEN. Risultati: Su queste cellule stiamo valutando gli inibitori di PI3K/AKT/ mTOR, Wortmannin e RAD001 in combinazione con farmaci che interferiscono con la via di AR. Inoltre abbiamo valutato l’inibizione sulla survivina nelle cellule trattate con una combinazione di YM155 e Abiraterone, Enzalutamide, o Docetaxel. La Wortmannin, inibisce PI3K; RAD001, inibitore di mTOR; YM155, inibisce la survivina. Abbiamo scelto diverse concentrazioni e i trattamenti sono stati effettuati per 24, 48 e 72 ore. La sopravvivenza è stata valutata con MTT, e la morte delle cellule con la colorazione del tripan blue. Infine per valutare la capacità delle cellule trattate di rientrare nel ciclo cellulare abbiamo allestito un test di clonogenicità dopo trattamenti di 24 ore. Le cellule trattate a 24 ore sono state processate per l’estrazione dell’RNA, dobbiamo valutare in RT-PCR l’espressione di alcuni geni per vedere l’azione dei composti sul ciclo cellulare (ciclina D, p27) e l’apoptosi (Bcl-2, Bvl-xl e Bax e survivina). Abbiamo studiato i primer ( ciclina D1, p27, Bcl-2, Bvl-xl e Bax e survivina ) e messo a punto le condizioni di RT-PCR, usando il SYBR Green, più adeguate per vedere l’assetto di questi geni comparati al gene GADPH. Conclusioni: Dai primi risultati è emerso che il docetaxel ha una maggiore capacità di inibire la crescita cellulare di entrambe le linee cellulari: dopo trattamento con 5nM solo il 14% e il 30% rispettivamente LnCaP e delle VCap continuano a proliferare. Il trattamento con Abiraterone riduce del solo 40% la crescita delle LnCap e del 20% quella delle VCaP, mentre l’Enzalutamide riduce del 55% le LnCaP (sopravvivono 45%) e del 30% (sopravvivono 70%) le VCap. Il trattamento di queste cellule con inibitori di PI3K/AKT/mTor effettivamente riduce la sopravvivenza delle cellule esaminare. Da questi primi risultati sulle LnCap emerge inibendo PI3K/mTor aumenta anche l’efficacia del trattamento di sostanze che agiscono su momenti diversi della sensibilità agli androgeni. Sulle VCaP abbiamo un quadro meno completo, queste cellule crescono molto lentamente.