Analisi del trascrittoma nel trapianto di cuore: caratterizzazione e validazione dei profili di espressione genica come nuovo strumento e biomarcatore di accompagnamento per il monitoraggio

Over the recent decade, there has been a greater focus on developing tissue-based gene expression approaches as companion tool for routine biopsy diagnosis in heart transplanted patients. Whole-transcriptome profiling have previously described the molecular phenotypes of allograft rejections and associated immune responses, even though still facing several hurdles for its application in routine clinical practice. The Banff Human Organ Transplant (BHOT) panel is a consensus list of 770 genes developed to facilitate cost-effective, reproducible expression analysis of solid organ allografts. In the first part of my thesis, I performed a methodological study analyzing the reliability of using FFPE EMB for transcriptome analysis compared to fresh frozen myocardial tissues. In the second part, to assess the BHOT panel reliability in detecting gene expression pattern associated to antibody-mediated rejection in heart allograft, I performed in silico analysis projecting the BHOT panel on already published microarray data of 141 heart transplant biopsies, performing differential expression, pathway, and network analysis. Hence, I replicate the same experimental design, projecting the BHOT panel also on microarray data of kidney allograft biopsies, but also evaluating the performance of the derived classification models. Finally, I built a multicenter reference set cohort comprising biopsies diagnosed with AMR (n=189), ACR (n=289) and non-rejection (n=114). Using a multivariate logistic regression model with 10-fold cross validation, I build molecular classifier for AMR and ACR rejection profiles, testing the performance in a separate validation cohort. In methodological study I demonstrated that transcriptome profile is not affected by preservation condition and RNA isolation procedure, showing good correlation and common signaling patterns. Then, I demonstrated that BHOT panel genes in the context of whole-transcriptome data captured the key gene signatures and pathophysiological mechanisms associated with AMR in heart allografts. Targeted versus whole-transcriptome analysis on kidney allograft biopsies demonstrated that the BHOT panel captures the key gene signatures and pathways associated with AMR and TCMR rejection. The performance of BHOT-based ensemble classification were highly similar to the performance of classifiers based on whole transcriptome data. The multicenter retrospective cohort of heart transplant biopsies showed that BHOT-based transcriptome analysis is a reliable tool compatible with pathological diagnosis. I showed good performances for the classifier models AMR and ACR. In particular, the performance of the BHOT-based model for detecting AMR showed an accuracy of 81.89% with a ROC-AUC= 0.844 and PR-AUC= 0.742, with a calibration Brier score of 0.143 and promising F1 score of 0.70. While the performance of the BHOT-based model for detecting ACR showed an accuracy of 77.58% with a ROC-AUC= 0.812 and PR-AUC= 0.827, with a calibration Brier score of 0.176 and good F1 score of 0.78. My PhD Thesis demonstrated that the FFPE material could be suitable for transcriptomic analysis, with comparable outcome if compared with fresh-frozen myocardial tissues. The BHOT gene panel in silico studies on well-phenotyped whole-transcriptome data in both heart and kidney allograft biopsies correctly captures rejection related profiles targeting elective adaptive and immune responses, giving a proof of concept that the targeted transcriptome approach can serve as a proxy to whole transcriptome-based analysis. Finally, I have created the first BHOT-sequencing based reference set of heart endomyobiopsies, selecting and phenotyping cases for both antibody-mediate and acute cellular mediated rejection. I generate reliable and consistent molecular based supervised models which represented a necessary first step to move from targeted transcriptome sequencing towards a companion molecular tool.

In campo trapiantologico, abbiamo assistito allo svilupparsi di un maggiore interesse verso l’applicazione di metodologie per l’analisi di espressione genica con l’utilizzo di tessuti, come strumento di accompagnamento della diagnosi nella pratica clinica per i pazienti trapiantati di cuore. L’analisi del trascrittoma ha descritto i fenotipi molecolari del rigetto dell'allotrapianto e le risposte immunitarie associate, anche se non sempre è riuscita a superare diversi ostacoli per la sua applicazione nella pratica clinica di routine. In particolare, è stato sviluppato un pannello Banff Human Organ Transplant (BHOT) per facilitare l'analisi dell'espressione del trascrittoma nel trapianto d’organo, con una buona riproducibilità di risultati e un rapporto costo beneficio vantaggioso. Nella prima parte del mio lavoro di tesi, ho condotto uno studio metodologico analizzando la possibilità di utilizzare FFPE EMB per l'analisi del trascrittoma rispetto al tessuto fresco. Nella seconda parte, per valutare l'affidabilità del pannello BHOT nel rilevare pattern significativi di espressione genica associati al rigetto nel trapianto cardiaco, ho eseguito un’analisi in silico proiettando il pannello BHOT su dati di microarray appartenenti a 141 biopsie endomiocardiache, eseguendo analisi di espressione differenziale e di valutazione del segnale patofisiologico. Lo stesso disegno sperimentale è stato condotto su dati di microarray di biopsie di allotrapianto renale, valutando anche modelli di classificazione molecolare derivati dalla proiezione in silico. Infine, ho costruito una coorte multicentrica comprendente biopsie endomiocardiche con diagnosi di AMR (n=189), ACR (n=289) e assenza di rigetto (n=114) altamente fenotipizzate. Utilizzando un modello di regressione logistica multivariata, ho costruito un classificatore molecolare per i profili di rigetto AMR e ACR, valutando le performance associate su una corte di validazione separata. Lo studio metodologico ha dimostrato che il profilo del trascrittoma non è influenzato dalle condizioni di conservazione e della procedura di isolamento dell'RNA, mostrando una buona correlazione di espressione genica. Abbiamo dimostrato che il pannello BHOT nel contesto dei dati derivati da microarray, cattura profili genici con i rispettivi meccanismi fisiopatologici associati all'AMR nel trapianto cardiaco. Allo stesso modo, l'analisi in silico del trascrittoma su biopsie di allotrapianto renale ha dimostrato che il pannello BHOT cattura i profili genici classificativi di rigetto AMR e TCMR. Gli identificativi molecolari derivati del BHOT risultano avere delle performance simili a quelle dei microarray. Infine, lo studio multicentrico internazionale su biopsie di trapianto cardiaco ha mostrato che l'analisi del trascrittoma basata su BHOT è uno strumento affidabile e compatibile con il substrato patologico. I classificatori molecolari sviluppati hanno mostrato ottime performance per rilevare l'AMR con un'accuratezza dell'81,89%, ROC-AUC= 0,844 e PR-AUC= 0,742, Brier score di 0,143 con F1 score di 0,70. Le performance del modello di classificatore molecolare basato su BHOT per la diagnosi dell'ACR hanno mostrato un'accuratezza del 77,58%, ROC-AUC= 0,812 e PR-AUC= 0,827, con Brier score di 0,176 e F1 di 0,78. Il nostro studio ha dimostrato che il materiale FFPE può essere adatto per l'analisi trascrittomica senza potenziali limitazioni. Gli studi in silico del pannello BHOT sia sulle biopsie endomiocardiache che renali hanno mostrato profili di trascrittoma identificativi di rigetto, confermando che l’uso del pannello BHOT fornisce risultati robusti e traslabili al microarray. Infine, ho creato il primo studio retrospettivo su biopsie endomiocardiache basato sul BHOT, caratterizzando il profillo molecolare per i tipi di rigetto AMR e ACR, con classificatori molecolari affidabili e coerenti, con la potenzialità di essere usati come supporto diagnostico complementare