Replication dynamics at common fragile site FRA6E (6q26)

Riassunto I siti fragili sono regioni instabili del genoma umano che mostrano una tendenza preferenziale a formare rotture cromosomiche o gap acromatici, visibili in cromosomi di cellule esposte, in coltura, a parziale inibizione della replicazione del DNA. Data la modalità di induzione, si ritiene che queste regioni siano costituite da DNA non replicato, formatosi in seguito allo stallo delle forche replicative. La presenza di DNA a singolo filamento può portare, quindi, alla formazione di rotture cromosomiche. L’instabilità a livello di questi siti è stata correlata alla formazione e allo sviluppo di diverse forme tumorali (Arlt et al., 2003). In base alla frequenza di espressione all’interno della popolazione umana, i siti fragili vengono suddivisi in due categorie: i siti fragili rari e i siti fragili comuni. I siti fragili rari, espressi in circa il 5% della popolazione umana, sono caratterizzati dalla presenza di ripetizioni di- o tri- nucleotidiche (CGG(n) e AT (n)). L’espressione dei siti fragili rari, ereditati con modalità mendeliana, è direttamente associata all’espansione degli elementi ripetuti che li caratterizzano. Il meccanismo è alla base di diverse patologie associate alle mutazioni dinamiche, di cui la sindrome dell’X fragile è un esempio. Invece i siti fragili comuni (CFS) sono sequenze costitutive dei cromosomi che presentano un’elevata instabilità strutturale espressa in vitro in condizioni di stress replicativo. Essendo una componente normale della struttura cromosomica, i CFS sono virtualmente espressi in tutti gli individui, anche se non con la stessa frequenza. Sono regioni ricche in AT e siti preferenziali di riarrangiamento, amplificazione genica, rotture cromosomiche. Essi occupano regioni molto ampie nel genoma, dell’ordine delle Mb, e presentano spesso al loro interno grandi geni con sequenze introniche molto lunghe (Glover et al., 2005), come ad esempio FHIT, WWOX e PARK2 presenti rispettivamente in FRA3B, FRA16D e FRA6E. Per alcuni di questi geni, inoltre, è stato dimostrato il ruolo di oncosoppressore (Schwartz et al., 2005). Dai dati presenti in letteratura, è noto che la replicazione dei siti fragili comuni avviene tardivamente all’interno della fase S (Le Beau et al., 1998), e si ritiene, quindi, che la formazione di rotture a doppio filamento in questi siti sia la conseguenza dello stallo delle forche replicative, riconducibile ad una perturbazione del processo replicativo. In questo studio, l’attenzione è stata focalizzata sul sito fragile comune FRA6E, il terzo CFS maggiormente espresso nella popolazione umana. FRA6E mappa sul cromosoma 6, in posizione q26, in una regione che presenta un’alta frequenza di riarrangiamenti in diversi tipi di tumori. All’interno di questo sito fragile comune mappano diversi geni ed alcuni di essi presentano lunghe sequenze introniche, come ad esempio ARID1B e PARK2; per quest’ultimo si suppone un ruolo di oncosoppressore. Nel laboratorio in cui ho lavorato, è stato dimostrato in precedenza che FRA6E si estende per circa 9 Mb (Russo et al., 2006) e può essere suddiviso in tre sottoregioni, in base al suo differente pattern di fragilità: la sottoregione centrale è meno fragile rispetto a quella centromerica, in cui mappa il gene ARID1B e a quella telomerica, in cui mappa PARK2. Lo scopo principale di questo progetto è stato quello di indagare se l’instabilità del sito fragile comune FRA6E può essere correlata a difetti nella sua replicazione. Lo studio della replicazione è stato effettuato grazie all’utilizzo di una tecnica innovativa, il molecular combing, che permette un’analisi molecolare ad alta risoluzione, in quanto le singole molecole di DNA vengono elongate in maniera uniforme su di un vetrino funzionalizzato. Per le molecole distese si ottiene la relazione 1 ?m = 2 Kb, e questo permette di effettuare delle misurazioni molto accurate. Combinando l’ibridazione di sonde specifiche, che permettono di visualizzare le regioni di interesse, è possibile valutarne il pattern replicativo, rilevando mediante immunofluorescenza il DNA in replicazione: infatti le cellule sono state marcate con due pulse consecutivi di analoghi di nucleotidi. La prima fase del progetto ha previsto la messa a punto del protocollo del molecular combing e delle varie procedure inerenti, in modo tale da poterla applicare efficacemente al nostro studio. La seconda fase del progetto si è focalizzata sull’analisi del pattern replicativo del sito fragile comune FRA6E, in relazione ad altre due regioni: il ben caratterizzato sito fragile comune FRA3B e il locus HPRT, utilizzato come regione di controllo. Per quanto riguarda FRA6E mi sono concentrata sullo studio della replicazione nelle due regioni di maggiore fragilità, dove mappano i geni ARID1B e PARK2, mentre per quanto riguarda FRA3B ho analizzato il core di fragilità, dove mappa il gene FHIT. Per condurre le analisi ad alta risoluzione del pattern replicativo delle diverse regioni di interesse sono stati utilizzati linfociti primari, estratti da sangue di due diversi donatori. Per ogni regione sono stati inoltre selezionati, attraverso analisi bioinformatiche, set di cloni genomici, da poter impiegare come sonde negli esperimenti di FISH su DNA elongato. Per descrivere le dinamiche di replicazione di ogni locus sono state determinati la velocità media delle forche replicative e gli eventuali eventi deregolativi (forche unidirezionali, eventi di arresto e asincronia nella velocità di progressione); è stata inoltre effettuata la mappatura delle origini di replicazione. I dati ottenuti suggeriscono che le velocità medie delle forche replicative sono simili in tutte le regioni analizzate. Tuttavia in FRA6E, la velocità media è più alta nella regione dove mappa il gene ARID1B rispetto a quella dove mappa PARK2, pur essendo entrambe in accordo con i dati pubblicati a livello dell’intero genoma (Conti et al., 2007). Inoltre, analizzando la distribuzione dei valori relativi alle velocità, rispetto a PARK2 la regione di ARID1B mostra una minore variabilità: infatti, la maggior parte delle osservazioni si collocano in una sottoregione di 200 Kb. Questa regione ha tutte le caratteristiche tipiche di una sequenza a replicazione tardiva. Nelle regioni di FRA6E-PARK2 e di FRA3B-FHIT la frequenza delle forche unidirezionali è risultata più elevata rispetto a quella osservata nelle regioni di FRA6E-ARID1B e HPRT. Inoltre, sono state mappate le posizioni delle origini attive di replicazione nelle varie regioni e sono state stimate le relative distanze, le quali risultano essere in accordo con i dati già pubblicati (Conti et al., 2007). Per determinare come l’induzione dello stress replicativo influisca sulla replicazione a livello delle regioni fragili, sono state stimate la velocità delle forche replicative e la dimensione dei repliconi, in popolazioni cellulari di controllo ed in seguito al trattamento con afidicolina (APH), un inibitore della DNA polimerasi, valutando diverse dosi e diverse tempistiche. Anzitutto l’analisi è stata affrontata a livello dell’intero genoma, e quindi dei loci di mio interesse. Dopo aver verificato che il trattamento con APH non arresta la progressione del ciclo cellulare, se non dopo 24 ore di trattamento con la dose più elevata, le analisi ad alta risoluzione hanno mostrato che, dopo due ore di trattamento, vi è un forte decremento della velocità di progressione delle forche replicative ed una conseguente diminuzione delle dimensioni dei repliconi.. Alla luce di questi dati ho quindi valutato la dinamica di replicazione all’interno delle diverse regioni di interesse, e in parallelo al molecular combing ho utilizzato anche tecniche di citogenetica molecolare classiche, quali la FISH su nuclei in interfase. Quest’ultima è stata importante per comprendere meglio quali siano le regioni a replicazione tardiva, e come atteso è emerso che i due siti fragili replicano più tardivamente delle regioni di controllo. Dall’analisi dei nuclei in interfase è emerso anche che il trattamento con afidicolina provoca un generale rallentamento della progressione della replicazione in tutti i loci considerati, tenuto conto delle differenti modalità di ciascuna regione. Per quanto riguarda lo studio condotto tramite l’utilizzo del molecular combing, queste analisi si sono concentrate sulla regione di FRA6E-PARK2 e del locus di controllo HPRT. I dati ottenuti mostrano una forte riduzione della velocità delle forche replicative, in accordo con i dati ottenuti a livello dell’intero genoma, e un aumento della frequenza delle forche unidirezionali in entrambe le regioni. Tuttavia, la risposta del sito fragile allo stress replicativo si manifesta soprattutto come un blocco molto evidente delle origini replicative, mentre nella regione di HPRT si assiste ad una aumentata attivazione di origini, come dimostrato dal fatto che la distanza stimata tra origini è significativamente inferiore a quella osservata nei linfociti di controllo. Nel corso del progetto ho valutato la possibilità di poter studiare la replicazione delle regioni di mio interesse in popolazioni cellulari arricchite per la fase S del ciclo cellulare: a questo scopo ho effettuato degli esperimenti di separazione delle cellule per centrifugazione elutriale. In questo modo si evita l’utilizzo di sostanze chimiche, che possono interferire con l’espressione delle regioni fragili. Questi esperimenti sono stati condotti utilizzando linee cellulari linfoblastoidi, perché era già stato verificato che il metodo non è utilizzabile con linfociti primari. L’isolamento di sottopopolazioni arricchite in fase S è stato possibile e consentirà di sviluppare ulteriormente le analisi sulle fasi tardive della replicazione del DNA, allo scopo di meglio comprendere la modalità con cui i siti fragili si replicano e rispondono allo stress replicativo.