L'orologio circadiano di Drosophila melanogaster in condizioni naturali e in regimi artificiali perturbati

L’orologio circadiano di Drosophila melanogaster in condizioni naturali e in regimi artificiali perturbati L’orologio circadiano di Drosophila melanogaster è basato su un sistema di loop molecolari interconnessi dove elementi “positivi” (le proteine CLOCK (CLK) e CYCLE (CYC)) inducono la trascrizione di elementi “negativi” (le proteine PERIOD (PER) e TIMELESS (TIM)) che a loro volta sono in grado di inibire la loro stessa trascrizione generando un periodo di circa 24 ore (Zordan et al., 2003). Questi loop circadiani sono regolati sia a livello trascrizionale che traduzionale e possono interagire con l’ambiente ricevendo stimoli luminosi e termici (Zeitgeber) in grado di sincronizzare l’orologio con i ritmi ambientali esterni (Lin et al 2001; Dunlap, 1999). I geni period e timeless originano diverse varianti di splicing dell’mRNA. Lo splicing temperatura sensibile di un introne di 89 paia di basi nella regione 3’ UTR (Untranslated region) del gene period determina la formazione di due tipi di mRNA: perunspliced e perspliced. La forma perspliced è prevalente a basse temperature e si accumula più rapidamente rispetto alla forma perunspliced, accelerando tutto il meccanismo molecolare circadiano. In conseguenza di ciò in condizioni di laboratorio (LD12:12) a basse temperature (18°C) la fase dell’attività locomotoria serale delle mosche è anticipata (Collins et al., 2004; Majercak et al., 2004). Anche per il gene timeless sono state individuate due varianti di splicing dell’mRNA: timnornal e timcold. Nella variante timcold viene ritenuto, a basse temperature, l’ultimo introne di 858 paia di basi. Anche in questo caso si tratta di uno splicing temperatura regolato (Boothroyd et al., 2007). Finora l’orologio circadiano è stato studiato in condizioni di laboratorio, condizioni che non riflettono la complessità e la variabilità degli stimoli presenti nell’ambiente esterno. Questo lavoro di tesi ha affrontato per la prima volta lo studio dell’orologio endogeno circadiano di Drosophila melanogaster in condizioni naturali mediante un’analisi a livello comportamentale e molecolare. Le osservazioni condotte hanno mostrato come il modello dell’orologio circadiano definito dagli esperimenti di laboratorio sia difficilmente applicabile in condizioni naturali e come molti aspetti dell’attività locomotoria, un fenotipo controllato dall’orologio endogeno, benché osservati in condizioni di laboratorio nelle linee mutanti per i principali geni orologio siano assenti in natura. Molti dei genotipi mutanti analizzati (per01, tim01, tim03, per01tim01, perS, perL, clkjerk, Pdf01, cry0) si sono dimostrati ritmici in condizioni naturali con una chiara attività mattutina e serale. La componente mattutina del comportamento è risultata essere, in condizioni naturali, una risposta regolata dal variare dei parametri ambientali esterni (luce e temperatura), mentre l’attività serale è apparsa maggiormente controllata dall’orologio endogeno. A livello molecolare è stato osservato un andamento ciclico dell’espressione dei geni period e timeless in condizioni naturali e la proporzione delle diverse varianti di splicing della trascrizione dei due geni sul totale dell’mRNA espresso è risultata temperatura dipendente sia in condizioni di laboratorio che in natura. D. melanogaster è anche un ottimo modello per lo studio del sonno e dei suoi disturbi. Il sonno nei mammiferi è il risultato dell’interazione tra un processo omeostatico e uno circadiano. Tutte le caratteristiche proprie del sonno come la postura, la diminuzione del livello di attenzione e l’insorgere di una soglia di risveglio sono state riconosciute e ridefinite nelle mosche (Hendricks et al., 2000; Shaw et al., 2000). Studi recenti hanno inoltre dimostrato come la deregolazione cronica del sonno si traduca in conseguenze negative per la salute aumentando il rischio di cancro e di molte malattie legate al sonno (Cho, 2001; Knutsson, 2003; Esquirol et al., 2009; Puttonen et al., 2010). La seconda parte del mio lavoro di tesi ha cercato di definire un modello per applicare e studiare gli effetti della turnazione nel lavoro (shift-work cronico) nelle mosche. E’ stata costruita un’apparecchiatura per mimare con le mosche regimi artificiali di shift-work. Le analisi condotte hanno mostrato che lo shift-work cronico nelle mosche produce effetti negativi sulla sopravvivenza e su alcuni fenotipi comportamentali associati alla percezione visiva del movimento. Nel loro insieme i risultati ottenuti hanno dimostrato come Drosophila possa essere considerata un buon modello per questo tipo di studi.