Mitochondrial axonal transport in vivo: development of a new assay in zebrafish to study the effects of Familial Alzheimerâ s Disease Presenilin 2 mutations

La malattia di Alzheimer (AD, Alzheimer' s disease) é la malattia neurodegenerativa più diffusa, colpendo più di 35 milioni di persone a livello mondiale. Nonostante la maggior parte dei casi sia dovuta ad una combinazione di fattori di rischio (genetici e ambientali), una piccola percentuale é ereditata geneticamente ed é perciò chiamata forma familiare di AD (FAD). Questa forma di Alzheimer é causata da mutazioni in tre geni: APP, che codifica per la proteina precursore dell'amiloide, e nei geni PSEN1 e PSEN2, codificanti rispettivamente per la presenilina 1 e 2 (PS1, PS2). Mutazioni in questi geni inducono un aumento nella formazione del prodotto del taglio di APP, il peptide β amiloide (Aβ): nella malattia i livelli di Aβ42, la forma di 42 amminoacidi del peptide Aβ più prona ad aggregare, sono aumentati portando alla formazione delle placche amiloidi che si ritrovano numerose nel cervello dei pazienti. Secondo " l' ipotesi amiloide" l'accumulo di Aβ innesca una cascata di eventi che porta ad una progressiva disfunzione a livello delle sinapsi e dei neuroni ed infine alla morte cellulare. In questo scenario, le preseniline svolgono un ruolo importante. Le preseniline sono proteine di membrana ben conosciute come componenti della γ-secretasi, un complesso enzimatico localizzato a livello della membrana plasmatica e delle membrane interne (Golgi e reticolo endoplasmatico, RE) responsabile del taglio di diverse proteine, tra cui NOTCH e APP. Tuttavia le preseniline svolgono anche funzioni indipendenti dalla γ-secretasi: in particolare é stato descritto recentemente che PS2, ma non PS1, é in grado di modulare la vicinanza tra RE e mitocondri, e lo scambio di Ca2+ tra questi due organelli. La sovra-espressione di mutazioni in PSEN2 associate a FAD aumenta sia la vicinanza fisica che il trasferimento di Ca2+ tra questi due organelli. Alterazioni nell' omeostasi intracellulare del Ca2+ sono comunemente riportate in diversi modelli sperimentali della patologia di Alzheimer e ciò ha fatto emergere un' ipotesi patogenetica aggiuntiva in cui tali fenomeni svolgono un ruolo chiave: molti processi cellulari, infatti, dipendono da un adeguato signalling intracellulare del Ca2+ e ci si aspetta che eventuali disfunzioni abbiano conseguenze sulla fisiologia del neurone. Tra i processi cellulari mediati dal Ca2+, il trasporto dei mitocondri lungo gli assoni rappresenta un punto fondamentale: i mitocondri sono organelli essenziali per la cellula, capaci di modulare, con la loro funzionalità, diversi aspetti della fisiologia della cellula. Il trasporto assonale dei mitocondri é finemente regolato dal Ca2+: aumenti nei livelli citosolici di Ca2+ interrompono il trasporto dei mitocondri lungo gli assoni, al fine di localizzarli in siti opportuni ad elevata attività  metabolica (ad es. in sinapsi attive). Le alterazioni nell' omeostasi intracellulare del Ca2+ così come l' aumentata vicinanza tra RE e mitocondri, dovuti all' espressione di mutazioni in PSEN2 associate a FAD, potrebbero quindi modificare il trasporto assonale dei mitocondri, e determinare alterazioni nella distribuzione dei mitocondri a livello neuronale, caratteristica riscontrata in diversi modelli di AD. Zebrafish si é dimostrato un modello animale molto attraente per studiare diverse malattie umane: in particolare, il suo genoma é ampiamente annotato e gli ortologhi dei geni coinvolti nelle forme familiari di AD sono già stati identificati. L' analisi del trasporto assonale dei mitocondri é facilitata dalla trasparenza degli embrioni e dalla disponibilità di strumenti che consentono di manipolare in maniera semplice l' espressione dei geni d' interesse. Nel lavoro qui presentato abbiamo generato una metodica che consente lo studio in vivo delle dinamiche assonali mitocondriali dipendenti dalla presenilina 2. Per prima cosa, attraverso l' espressione della proteina fluorescente Kaede indirizzata ai mitocondri dei neuroni sensitivi Rohon-Beard (RB), abbiamo caratterizzato le proprietà del trasporto assonale dei mitocondri nel corso dello sviluppo: la percentuale di mitocondri mobili si riduce passando da embrioni di un giorno a quelli di tre; tuttavia la velocità media del loro trasporto aumenta nel corso dello sviluppo. La direzionalità del trasporto assonale dei mitocondri é fortemente sbilanciata verso il trasporto anterogrado, rispecchiando una traslocazione netta di mitocondri dal corpo cellulare alle ramificazioni assonali terminali. Il trattamento con nocodazolo, un forte inibitore della polimerizzazione dei microtubuli, altera completamente il trasporto assonale dei mitocondri, validando così la sensibilità del nostro metodo di analisi. Le caratteristiche del trasporto mitocondriale misurate con il nostro approccio, inoltre, sono simili a quelle riportate in altri studi in vivo recentemente pubblicati. Successivamente, abbiamo verificato la presenza di eventuali effetti sul trasporto indotti dall' espressione di presenilina 2: abbiamo dimostrato come il knockdown di psen2, ma non di psen1, riduce la percentuale di mitocondri mobili. Questo fenotipo é ripristinato da esperimenti di rescue, in cui viene re-introdotto il gene per la presenilina 2, dimostrando un effetto specifico della proteina. L' espressione della PS2 umana in zebrafish ha portato a risultati diversi: la proteina umana (sia wild-type, wt, che mutata) si esprime nelle membrane interne a livello del corpo cellulare e lungo l' assone dei neuroni RB, dove si localizza principalmente a livello del RE. Mentre però la sovra-espressione della PS2 wt non ha alcun effetto sul trasporto assonale dei mitocondri, la forma mutata PS2-T122R aumenta la percentuale di mitocondri mobili. Abbiamo inoltre verificato se aumenti di Ca2+ a livello della matrice mitocondriale, indotti da un aumento del Ca2+ a livello citosolico, potessero funzionare da segnale coinvolto nella regolazione del trasporto mitocondriale, come recentemente proposto: il knockdown della proteina principale dell' uniporto mitocondriale del calcio (Mcu, Mitochondrial calcium uniporter), tuttavia, non ha nessun effetto sia sulla percentuale di mitocondri mobili che sulla loro velocità media. Dato che cambiamenti nella forma dei mitocondri possono influenzarne velocità e trasporto abbiamo analizzato anche la morfologia e la densità dei mitocondri lungo gli assoni dei neuroni RB dopo espressione di PS2 umana: entrambi i parametri tuttavia sono risultati invariati nelle varie condizioni analizzate, suggerendo che le alterazioni osservate nel trasporto mitocondriale indotte dalla PS2 non siano dovute né ad uno squilibrio nella fusione/fissione né ad una alterata biogenesi dei mitocondri. Ulteriori studi saranno necessari per comprendere il meccanismo che modula l' alterato trasporto mitocondriale qui descritto, così come il peso di queste alterazioni nella patogenesi dell' Alzheimer.