SNARE complexes associate in a rosette-like structure at the Drosophila neuromuscular junction

L’esocitosi regolata è un processo essenziale in tutte le cellule eucariotiche. A livello della sinapsi, il rilascio di molecule contenute all’interno delle vescicole è mediato dalla formazione del complesso SNARE, costituito dall’interazione di tre proteine: sintassina, SNAP‐25 e VAMP/sinaptobrevina. Numerose evidenze sperimentali suggeriscono che la cooperazione tra complessi SNARE adiacenti sia necessaria affinché una vescicola sinaptica si fonda con la membrane plasmatica. Da un’analisi della sequenza amminoacidica dell’isoforma neuronale di questa proteina è emerso che, nella porzione C‐terminale, un residuo aminoacidico è altamente conservato anche se non è situate nella regione di interazione tra SNAP‐25 e le altre componenti molecolari del complesso. In mammifero, tale residuo è l’arginina in posizione 198. Esperimenti condotti incubando la giunzione neuromuscolare di topo in presenza della tossina botulinica di tipo A hanno evidenziato il ruolo chiave della porzione C‐terminale della proteina SNAP‐25 nel processo di fusion vescicolare e, in particolare, dell’Arg198, poiché la tossina taglia esattamente la proteina a monte di questo residuo, determinando il blocco dell’esocitosi. Inoltre, simulazione di modeling effettuate al computer hanno suggerito che tale arginine interagisce con un amminoacido carico negativamente posizionato sulla sintassina del complesso SNARE adiacente, formando di un legame ionico. Questa ipotesi è stata verificata in vivo usando Drosophila melanogaster come organismo modello. Poiché nel moscerino della frutta la sequenza di SNAP‐25 è più lunga di quella in mammifero, l’arginina conservata risulta essere in posizione 206. Tale Arg206 è stata sostituita con un’alanina mediante mutagenesi sitospecifica. Quindi, sono state generate due linee transgeniche in cui i costrutti pUAST‐SNAP‐25WT e pUAST‐SNAP‐25R206A sono stati inseriti in background SNAP‐25 wild‐type. Sfruttando il sistema GAL4/UAS, i transgeni sono stati espressi nel sistema nervoso utilizzando il driver pan‐neuronale ElavGAL4. In entrambe le linee ElavGAL4/UAS‐SNAP‐25WT (controllo) (controllo) e ELAV‐GAL4/UAS‐SNAP‐25R206A (mutante) sono stati quantificati i profili di espressione dell’mRNA dei trascritti mutante e wild‐type; inoltre, è stata caratterizzata la giunzione neuromuscolare a livello larvale, musurandone la morfologia e la morfometria. L’analisi elettrofisiologica del rilascio spontaneo ed evocato ha mostrato una significativa riduzione della probabilità di fusione tra vescicola e membrana plasmatica. Questo risultato conferma il ruolo chiave ricoperto dall’Arg206 durante il processo di esocitosi a livello del terminale sinaptico e supporta l’ipotesi secondo cui i complessi SNARE cooperano tra loro, formando un supercomplesso necessario alla formazione del poro di fusione.