Antimicrobial peptide-mediated immune response in four Bombyx mori strains infected with Gram-positive and -negative pathogens

Il baco da seta, Bombyx mori, oltre a possedere un’importanza economica intrinseca, è ampiamente utilizzato sia come sistema modello per i Lepidotteri, che nel campo delle biotecnologie. In seguito alla domesticazione si sono originati numerosi ceppi, che possono essere classificati sulla base della loro origine geografica in giapponesi, cinesi, europei e tropicali. In genere, i ceppi che provengono dalle aree temperate mostrano una maggiore produttività, ma anche una più alta suscettibilità alle infezioni, mentre i ceppi di origine tropicale risultano essere più resistenti alle infezioni. Lo scopo di questo progetto consisteva nell’identificare quali potessero essere gli elementi chiave della resistenza del B. mori alle infezioni. Il fine ultimo era di creare dei ceppi di baco da seta che fossero più tolleranti ai patogeni, ma che mantenessero comunque buone capacità produttive. Per raggiungere questi obiettivi, sono stati utilizzate due principali strategie: 1) la caratterizzazione della risposta immunitaria indotta da infezioni orali di quattro ceppi di baco da seta originatisi rispettivamente in Giappone, Cina, Europa ed India, ponendo particolare attenzione sui peptidi antimicrobici (AMP), i principali effettori dell’immunità innata; 2) la produzione e la caratterizzazione di linee transgeniche over-esprimenti i geni codificanti gli AMP. In primo luogo abbiamo caratterizzato la morfologia delle membrane peritrofiche e degli epiteli intestinali dei quattro ceppi allevati in condizioni sterili. Queste strutture rappresentano la prima barriera fisica durante le infezioni orali. Successivamente, abbiamo valutato la variabilità genetica dei quattro ceppi a livello dei 21 geni codificanti per gli AMP di B. mori, identificando numerose sostituzioni amminoacidiche nella porzione attiva dei peptidi. Abbiamo quindi sottoposto i quattro ceppi ad infezione orale con due batteri, specifici patogeni del baco da seta: Enterococcus mundtii, Gram-positivo, e Serratia marcescens, Gram-negativo. In seguito ad un’infezione di 24 ore abbiamo valutato la risposta differenziale dei quattro ceppi confrontando: 1) i profili di sopravvivenza, 2) la presenza di cellule batteriche vive nell’emolinfa, 3) l’induzione dell’espressione dei geni codificanti 9 AMP rappresentativi, 4) l’attività antimicrobica dell’emolinfa, 5) la concentrazione del Lisozima nel plasma, 6) la velocità di melanizzazione dell’emolinfa. Per quanto riguarda l’infezione con E. mundtii, il ceppo europeo è risultato essere il più resistente, seguito dal cinese, dall’indiano e dal giapponese. I dati ottenuti indicano che le classi e i tipi di AMP prodotti dal ceppo europeo, sia a livello locale che a quello sistemico, possano essere l’effettiva causa della maggiore resistenza di questo ceppo. A seguito dell’infezione con S. marcescens, il ceppo Indiano si è rivelato essere totalmente resistente a questo patogeno, mentre nessuno degli altri tre ceppi è sopravvissuto all’infezione. Abbiamo trovato una generale correlazione tra il profilo di sopravvivenza e l’attivazione sistemica degli AMP. Infatti nell’emolinfa dei bachi da seta indiani non sono state isolate cellule batteriche di S. marcescens e solamente questo ceppo ha mostrato un’induzione della trascrizione della maggior parte degli AMP. Sono necessarie ulteriori analisi per verificare se il ceppo indiano possieda meccanismi di riconoscimento o vie di trasduzione del segnale più efficaci per questo tipo di infezione. Infine sono stati generati tre differenti costrutti basati sull’elemento trasponibile piggyBac per ottenere ceppi di baco da seta transgenici con una maggiore resistenza alle infezioni. Sono state ottenute due linee indipendenti over-esprimenti il gene per la Moricina. Al momento si stanno caratterizzando queste linee per verificare la loro resistenza alle infezioni.