Individuazione e caratterizzazione di geni implicati nelle paraparesi spastiche ereditarie

Le paraparesi spastiche ereditarie (HSP) sono un gruppo di disordini neurodegenerativi caratterizzate da progressiva spasticità e debolezza degli arti inferiori. Nelle forme complicate si possono osservare altre manifestazioni neurologiche o non neurologiche associate alla spasticità. I dati presenti in letteratura sulle HSP ad oggi riportano 39 loci mappati su diversi cromosomi e sono descritte sia forme a trasmissione autosomica dominante, che recessiva, che X-linked. Nei pazienti affetti da HSP sono state trovate mutazioni in 18 diversi geni coinvolti nel trafficking intracellulare, nel trasporto assonale e in anomalie nel funzionamento dei mitocondri. In un tale scenario in cui la quantità di informazioni raccolte sono molte, non è facile scegliere quale strada intraprendere per determinare da quale forma di HSP un paziente risulti affetto, né tanto meno accrescere, con dati di rilievo, le conoscenze generali. In questi tre anni sono stati studiati molti casi isolati ed alcuni casi familiari che presentavano un fenotipo di HSP complicata, con l’intenzione di individuare il locus e/o il gene coinvolto nei diversi pazienti. In primo luogo è stato analizzato un campione di 10 soggetti con uno grave fenotipo caratterizzato da spasticità agli arti inferiori, idrocefalo, ritardo mentale e pollici addotti (sindrome di CRASH). In questi individui, mediante sequenziamento diretto sono state studiate le regioni codificanti del gene L1CAM, associato alla sindrome di CRASH. Cinque nuove mutazioni sono state trovate in altrettanti pazienti non correlati, più una descritta in precedenza. La maggior parte delle mutazioni identificate in questo studio sono localizzate nella porzione extracellulare della proteina matura che svolge un ruolo primario nelle iterazioni omo- ed etero-filiche proteina-proteina. Nei pazienti privi di mutazioni puntiformi nelle regioni codificanti è stata condotta un’analisi di duplicazione del gene L1CAM mediante differenti metodiche (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification e Real Time-PCR). Nessuno degli individui analizzati si è dimostrato essere portatore di tali riarrangiamenti. Nella seconda parte di questo lavoro si è proceduto con un’indagine molecolare su 3 famiglie affette da paraparesi spastica complicata a trasmissione autosomica recessiva. Nella prima famiglia (Fam. 1) con HSP associata a deficit cognitivo è stata eseguita un’indagine preliminare di esclusione dei loci coinvolti nella HSP. Sono stati valutati geni candidati nella regione di linkage più promettente, ma non sono state trovate mutazioni causative. Ulteriori analisi saranno necessarie per comprendere quale forma di paraparesi spastica sia responsabile della patologia negli affetti di questa famiglia. Nella seconda famiglia (Fam. 2) a cui è stata diagnosticata, in due fratelli, una forma di HSP complicata da sospetto assottigliamento del corpo calloso si è proceduto con la caratterizzazione della regione 15q21.1 dove mappa il geneSPG11 tra i marcatori D15S994 e D15S978. Data la condivisione del genotipo negli individui affetti si è proceduto con il sequenziamento del gene SPG11. Apparentemente i due fratelli affetti risultavano omozigoti per un’inserzione di tre paia di basi a livello del sito di splicing dell’esone 39 (c.7000-3_-4insAGG; NM_025137). Ulteriori analisi hanno dimostrato che sono invece portatori di due mutazioni diverse, la mutazione descritta inizialmente ed una delezione di 2,76 kb tra gli introni 36 e 39 (c.6754_7152del1397). Per il terzo nucleo familiare, 11 fratelli nati da genitori consanguinei (Fam. 3), in passato erano già state eseguite delle analisi (genome-wide search e fine mapping) per cui era stata individuata una regione di omozigosità sul cromosoma 21. Solo gli individui affetti, tre fratelli con HSP complicata da un lieve ritardo mentale e neuropatia periferica, in questa regione condividevano l’assetto genotipico. L’analisi dei geni candidati ha portato all’individuazione di una sostituzione di un singolo nucleotide (T?C) sul 3’UTR del gene STCH (Heat shock protein 70 family member 13) localizzato in posizione 21q11.2 che cosegrega con la patologia e non risulta presente in 300 individui sani analizzati. Uno studio funzionale preliminare ha permesso di valutare gli effetti di questa variazione nella linea cellulare murina motoneurone-simile NSC34. Usando un vettore modificato esprimente il gene della luciferasi fuso con il 3’UTR del gene STCH si è potuto osservare una differente attività trascrizionale evidenziata come minor attività della luciferasi in presenza dell’allele mutato. Tenuto conto che tale sostituzione nucleotidica potrebbe attivare un sito target di appaiamento criptico per un microRNA è stata eseguita un’analisi in silico ed in vitro per selezionare i microRNA che potrebbero interagire con il trascritto di tale gene. Al momento appaiono candidati i miRNA: hsa-miR-134, hsa-miR-194, hsa-miR-637, hsa-miR-758 e hsa-miR-924.